Mitochondrial rewiring drives metabolic adaptation to NAD(H) shortage in triple negative breast cancer cells  

線粒體重新布線驅(qū)動(dòng)三陰性乳腺癌細(xì)胞對 NADH短缺的代謝適應(yīng)

期刊：Neoplasia  

來源：ScienceDirect (DOI: https://doi.org/10.1016/j.neo.2023.100903)  

 

摘要核心內(nèi)容

 

本研究探討三陰性乳腺癌（TNBC）細(xì)胞對NAMPT抑制劑FK866耐藥的代謝適應(yīng)機(jī)制。通過建立FK866耐藥細(xì)胞模型（MDA-MB-231 RES），研究發(fā)現(xiàn)：  

耐藥機(jī)制獨(dú)立于經(jīng)典藥泵外排或補(bǔ)償性NAD?合成通路（如NMRK1），而依賴線粒體代謝重組。  

 

線粒體功能增強(qiáng)：耐藥細(xì)胞線粒體備用呼吸能力（SRC）、線粒體質(zhì)量（mtDNA/nDNA比例增加）及生物合成（PGC-1α/TFAM上調(diào)）顯著提升。  

 

代謝底物依賴性改變：耐藥細(xì)胞更依賴丙酮酸和琥珀酸氧化供能，且線粒體丙酮酸載體MPC2的抑制可誘導(dǎo)敏感細(xì)胞產(chǎn)生類耐藥表型。  

 

關(guān)鍵結(jié)論：持續(xù)NAD(H)短缺驅(qū)動(dòng)線粒體重編程，通過增強(qiáng)氧化磷酸化（OXPHOS）和底物靈活性（丙酮酸→琥珀酸轉(zhuǎn)換）維持能量穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致FK866耐藥。  

 

研究目的

 

探究TNBC細(xì)胞對NAMPT抑制劑FK866耐藥的分子機(jī)制，重點(diǎn)關(guān)注線粒體代謝適應(yīng)在抵抗NAD(H)短缺中的作用，為克服耐藥提供新靶點(diǎn)。  

 

研究思路

 

模型建立：  

 

通過長期遞增FK866暴露，構(gòu)建MDA-MB-231耐藥細(xì)胞系（RES）。  

耐藥機(jī)制初篩：  

 

排除NAMPT突變、藥泵外排（ABCB1/ABCC1）及補(bǔ)償性NAD?合成通路（NMRK1沉默驗(yàn)證）。  

線粒體功能聚焦：  

 

Seahorse分析糖酵解率（GlycoPER）和線粒體呼吸功能（OCR）。  

 

評(píng)估線粒體質(zhì)量（mtDNA/nDNA比例、MitoTracker染色）、生物合成基因（PGC-1α/TFAM）及底物依賴性（Mitoplate S-1）。  

關(guān)鍵靶點(diǎn)驗(yàn)證：  

 

藥理學(xué)（UK5099/羅格列酮抑制MPC）和遺傳學(xué)（siRNA沉默MPC1/MPC2）干預(yù)，結(jié)合FK866處理。  

 

呼吸鏈復(fù)合物活性及ATP合成酶功能檢測。  

機(jī)制整合：  

 

解析丙酮酸→琥珀酸代謝轉(zhuǎn)換在維持膜電位（Δψm）和能量供應(yīng)中的作用。  

 

測量數(shù)據(jù)及其意義

 

（1）耐藥表型與機(jī)制排除（圖1）

數(shù)據(jù)：RES細(xì)胞對FK866完全耐藥（EC??不可計(jì)算），但對化療藥物（5FU、順鉑）敏感；Verapamil/CsA處理不逆轉(zhuǎn)耐藥；ABCB1/ABCC1表達(dá)無差異。  

 

意義：耐藥非經(jīng)典藥泵介導(dǎo)，提示代謝適應(yīng)主導(dǎo)。  

來源：圖1A-G。  

 

（2）NAD?合成通路無補(bǔ)償作用（圖2）

數(shù)據(jù)：RES細(xì)胞NAMPT/NAPRT下調(diào)、NMRK1上調(diào)，但NMRK1沉默不增敏FK866；NAD(H)/ATP水平不變。  

 

意義：補(bǔ)償性NAD?合成非關(guān)鍵耐藥機(jī)制。  

 

來源：圖2B-H。  

 

（3）線粒體功能增強(qiáng)（圖3）

數(shù)據(jù)：  

 

RES細(xì)胞備用呼吸容量（SRC） 顯著升高（Seahorse OCR）。  

 

線粒體質(zhì)量增加：mtDNA/nDNA比例↑、TOMM20蛋白↑、PGC-1α/TFAM轉(zhuǎn)錄上調(diào)、MitoTracker熒光強(qiáng)度↑2倍。  

 

意義：線粒體生物合成與功能擴(kuò)容是核心適應(yīng)策略。  

 

來源：圖3A-G。  

 

（4）代謝底物依賴性轉(zhuǎn)變（圖4）

數(shù)據(jù)：Mitoplate分析顯示RES細(xì)胞對丙酮酸+低劑量蘋果酸氧化速率↑；UK5099（MPC抑制劑）降低RES細(xì)胞最大呼吸。  

 

意義：耐藥細(xì)胞依賴丙酮酸作為碳源，MPC介導(dǎo)的丙酮酸輸入至關(guān)重要。  

 

來源：圖4A-C。  

 

（5）MPC2抑制誘導(dǎo)類耐藥表型（圖5）

數(shù)據(jù)：  

 

UK5099/羅格列酮聯(lián)合FK866提升敏感細(xì)胞存活率。  

 

MPC2沉默（非MPC1）部分挽救FK866導(dǎo)致的細(xì)胞死亡和ATP耗竭。  

 

意義：MPC2功能抑制模擬耐藥表型，驗(yàn)證其介導(dǎo)代謝適應(yīng)的必要性。  

 

 

來源：圖5A-D。  

 

（6）琥珀酸依賴性與能量維持（圖6）

數(shù)據(jù)：  

 

呼吸鏈復(fù)合物I-IV活性無差異，但ATP合成酶活性在FK866+UK5099處理下RES細(xì)胞更高。  

 

丹麥Unisense微電極數(shù)據(jù)：RES細(xì)胞在丙酮酸剝奪（UK5099）下，琥珀酸氧化耗氧率（OCR） 顯著高于敏感細(xì)胞（圖6G）。  

 

意義：耐藥細(xì)胞通過琥珀酸氧化維持膜電位（Δψm）和ATP合成，提供代謝靈活性。  

 

來源：圖6A-G。  

 

研究結(jié)論

 

線粒體代謝重組是耐藥核心：FK866持續(xù)暴露誘導(dǎo)線粒體生物合成（質(zhì)量↑）和功能擴(kuò)容（SRC↑），增強(qiáng)OXPHOS能力。  

 

底物靈活性驅(qū)動(dòng)適應(yīng)：耐藥細(xì)胞從丙酮酸依賴轉(zhuǎn)向琥珀酸高效利用（Unisense數(shù)據(jù)證實(shí)），維持能量穩(wěn)態(tài)。  

 

MPC2是關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)：抑制MPC2（非MPC1）誘導(dǎo)敏感細(xì)胞產(chǎn)生類耐藥表型，靶向MPC2或可逆轉(zhuǎn)化療耐藥。  

 

丹麥Unisense微電極數(shù)據(jù)的詳細(xì)解讀

 

測量方法與結(jié)果（圖6G）

技術(shù)原理：Unisense微電極通過實(shí)時(shí)耗氧率（OCR） 檢測，評(píng)估線粒體底物氧化效率。細(xì)胞經(jīng)皂苷透化后，分別提供：  

 

丙酮酸+蘋果酸（激活復(fù)合物I通路）。  

 

琥珀酸+魚藤酮（激活復(fù)合物II通路，抑制復(fù)合物I）。  

 

關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：  

 

耐藥細(xì)胞琥珀酸OCR更高：RES細(xì)胞在琥珀酸底物下OCR顯著高于PAR細(xì)胞（*p<0.01），表明其增強(qiáng)琥珀酸氧化能力。  

 

代謝靈活性：UK5099抑制丙酮酸輸入后，RES細(xì)胞仍通過琥珀酸維持高OCR；FK866處理不影響其琥珀酸利用效率。  

 

敏感細(xì)胞的補(bǔ)償失敗：PAR細(xì)胞在丙酮酸剝奪后琥珀酸OCR無代償性提升，且FK866進(jìn)一步抑制呼吸功能。  

 

研究意義

揭示代謝可塑性：Unisense數(shù)據(jù)首次直接證明耐藥細(xì)胞通過琥珀酸氧化繞過丙酮酸短缺，維持線粒體呼吸，解釋其能量供應(yīng)韌性。  

 

提供耐藥新靶點(diǎn)：琥珀酸代謝途徑（如復(fù)合物II）或可成為克服NAMPT抑制劑耐藥的新干預(yù)方向。  

 

技術(shù)優(yōu)勢：Unisense微電極提供實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)呼吸功能數(shù)據(jù)，彌補(bǔ)Seahorse靜態(tài)分析的不足，精準(zhǔn)捕捉底物轉(zhuǎn)換的代謝適應(yīng)性。  

 

總結(jié)：本研究闡明TNBC細(xì)胞通過線粒體重編程（生物合成增強(qiáng)、底物靈活性提升）抵抗NAD(H)短缺導(dǎo)致的FK866毒性。丹麥Unisense微電極數(shù)據(jù)為核心機(jī)制（琥珀酸依賴）提供直接證據(jù)，為靶向線粒體代謝逆轉(zhuǎn)耐藥提供理論依據(jù)。