Kinetic, genomic, and physiological analysis reveals diversity in the ecological adaptation and metabolic potential of Brachybacterium equifaecis sp. nov. isolated from horse feces

通過動力學(xué)、基因組和生理學(xué)分析，揭示了從馬糞中分離出的 短桿馬糞桿菌 新種在生態(tài)適應(yīng)性和代謝潛力方面的多樣性。

  

期刊：Microbiology Spectrum  

DOI：10.1128/spectrum.05048-22  

 

摘要核心內(nèi)容

 

本研究從馬糞中分離出一株新型放線菌Brachybacterium equifaecis JHP9，通過多維度分析（系統(tǒng)發(fā)育、基因組、生理生化及動力學(xué)）揭示其生態(tài)適應(yīng)性與代謝多樣性：  

分類學(xué)地位：基于16S rRNA相似性（≤97.9%）、ANI（79.5-82.5%）、AAI（66.7-75.8%）和isDDH（23.7-27.9%）確認(rèn)為新種。  

 

動力學(xué)特性（首次報(bào)道）：  

 

高底物親和力：葡萄糖親和力（Km(app) = 0.73–1.22 μM）和氧親和力（Km(app) = 0.73–1.22 μM），體現(xiàn)其寡營養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)策略（K-策略）。  

代謝多樣性：  

 

利用多種碳源（如甘露糖、蔗糖）產(chǎn)乳酸，產(chǎn)量顯著高于部分乳酸菌（如Lactobacillus delbrueckii）。  

 

基因組編碼豐富CAZymes（糖苷水解酶GH、糖基轉(zhuǎn)移酶GT等），支持碳水化合物代謝。  

防御機(jī)制：  

 

攜帶CRISPR-Cas（I-E型）和BREX系統(tǒng)，抵抗外源DNA入侵。  

 

攜帶抗生素抗性基因（如gyrA、gyrB抗喹諾酮類），但表型僅對氯霉素和卡那霉素耐藥（表S4）。  

生態(tài)適應(yīng)性：  

 

耐鹽（0–10% NaCl）、廣pH適應(yīng)（pH 6–9），含氧化應(yīng)激基因（超氧化物歧化酶、過氧化氫酶）。  

 

關(guān)鍵詞：Brachybacterium equifaecis JHP9、細(xì)胞動力學(xué)、基因組獨(dú)特性、CRISPR-Cas系統(tǒng)、發(fā)酵、乳酸菌  

 

研究目的

分離鑒定馬糞來源的新型Brachybacterium菌株并確立其分類地位。  

 

探究該屬菌株的代謝多樣性（碳源利用、乳酸生產(chǎn)）及生態(tài)適應(yīng)性（底物親和力、應(yīng)激響應(yīng)）。  

 

通過比較基因組學(xué)解析其防御機(jī)制（CRISPR、抗生素抗性）和生態(tài)位分化策略。  

 

研究思路

菌株分離與鑒定：  

 

從馬糞樣本中分離JHP9菌株，通過透射電鏡確認(rèn)形態(tài)（桿狀/球狀轉(zhuǎn)換），生理生化測試確定生長條件（溫度、pH、鹽度）。  

 

基于16S rRNA和核心基因組系統(tǒng)發(fā)育分析（圖1A-B），結(jié)合ANI/AAI/isDDH值界定新種。  

基因組分析：  

 

測序JHP9基因組（3.08 Mbp，GC含量71.1%），注釋CAZymes、抗性基因、CRISPR系統(tǒng)（表2）。  

 

泛基因組分析（7株Brachybacterium），揭示核心基因（氨基酸代謝、能量代謝）和附屬基因（碳水化合物代謝、異生物質(zhì)降解）（圖2）。  

 

生理與動力學(xué)實(shí)驗(yàn)：  

 

乳酸生產(chǎn)：測試6種糖源發(fā)酵能力（圖4）。  

 

底物親和力：使用Unisense微電極系統(tǒng)測量氧/葡萄糖消耗動力學(xué)（圖5）。  

 

生態(tài)適應(yīng)性驗(yàn)證：  

 

耐鹽/滲透壓調(diào)節(jié)（BetT基因）、氧化應(yīng)激（SOD/CAT基因）、移動遺傳元件（IS轉(zhuǎn)座子）分析。  

 

測量數(shù)據(jù)與研究意義

分類學(xué)與基因組特征（圖1, 表1）

 

數(shù)據(jù)：  

 

16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹顯示JHP9與B. nesterenkovii相似性97.9%（圖1A）。  

 

核心基因組聚類證實(shí)JHP9獨(dú)立成簇（圖1B）。  

 

意義：確立B. equifaecis為新種，豐富放線菌資源庫。  

乳酸生產(chǎn)能力（圖4）

 

數(shù)據(jù)：  

 

JHP9利用甘露糖/蔗糖產(chǎn)乳酸濃度最高（≈200 μM），顯著高于其他菌株（圖4）。  

 

意義：揭示其作為潛在工業(yè)乳酸生產(chǎn)菌的應(yīng)用價(jià)值。  

底物親和力動力學(xué)（圖5）

 

數(shù)據(jù)：  

 

葡萄糖親和力：JHP9的Km(app) = 1.9 μM（圖5A），高于E. coli（≈2.5 μM）。  

 

氧親和力：所有測試菌株Km(app) = 0.73–1.22 μM（圖5B），接近寡營養(yǎng)菌水平。  

 

意義：高親和力使其在低營養(yǎng)環(huán)境中競爭優(yōu)勢顯著，解釋其在馬腸道的定植能力。  

防御與抗性基因（表2）

 

數(shù)據(jù)：  

 

JHP9攜帶I-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)（3個(gè)CRISPR陣列，8個(gè)Cas蛋白）。  

 

基因組預(yù)測gyrA/gyrB（抗喹諾酮），但表型僅耐氯霉素/卡那霉素。  

 

意義：反映基因組可塑性及環(huán)境壓力下的適應(yīng)性進(jìn)化。  

 

Unisense微電極技術(shù)的深度解析

 

技術(shù)原理與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)備組成：  

 

OX-MR氧微傳感器（Unisense, Denmark）：尖端直徑500 μm，實(shí)時(shí)監(jiān)測溶解氧濃度。  

 

PA 2000皮安計(jì)：高靈敏度電流檢測（檢測限≈1 nM O?）。  

 

磁力攪拌反應(yīng)室：維持均質(zhì)懸浮液，避免擴(kuò)散限制。  

 

校準(zhǔn)方法：  

 

預(yù)極化24小時(shí)，零氧（連二亞硫酸鈉）和飽和氧（空氣飽和緩沖液）兩點(diǎn)校準(zhǔn)。  

 

實(shí)驗(yàn)流程：  

 

菌體濃縮后懸浮于人工淡水培養(yǎng)基（AFM）。  

 

逐步添加葡萄糖/調(diào)節(jié)氧濃度，記錄氧消耗速率（OUR）。  

 

通過米氏方程擬合Km(app)和Vmax。  

 

研究意義

揭示寡營養(yǎng)生存策略：  

 

測得極低Km(app)值（0.73–1.22 μM O?），表明JHP9可在缺氧腸道環(huán)境中高效利用微量氧，優(yōu)于多數(shù)異養(yǎng)菌（如Pseudomonas chlororaphis Km≈5 μM）。  

解析能量代謝效率：  

 

葡萄糖:O?消耗比≈1:6，符合有氧呼吸化學(xué)計(jì)量，證實(shí)其呼吸鏈完整性。  

技術(shù)優(yōu)勢：  

 

高時(shí)空分辨率：微電極直接插入活細(xì)胞懸液，避免傳統(tǒng)溶氧電極的混合延遲。  

 

生理相關(guān)性：在接近原位條件（30°C，pH 7）下測量，數(shù)據(jù)更貼合真實(shí)生態(tài)行為。  

應(yīng)用拓展：  

 

為微生物生態(tài)位分化提供量化指標(biāo)（如r/K策略），適用于極端環(huán)境微生物研究。  

 

局限性

單點(diǎn)測量局限：微電極僅反映局部氧濃度，對空間異質(zhì)性環(huán)境（如生物膜）適用性有限。  

 

細(xì)胞密度依賴：高菌濃可能導(dǎo)致微環(huán)境擾動，需控制生物量（本研究菌量≈10? cells/mL）。  

 

結(jié)論

新種描述：B. equifaecis JHP9為馬糞來源新種，模式菌株KCTC 49746T。  

 

生態(tài)適應(yīng)性：  

 

高底物親和力（K-策略）、廣碳源利用、乳酸發(fā)酵能力，適應(yīng)馬腸道寡營養(yǎng)環(huán)境。  

 

CRISPR-Cas和抗生素抗性基因增強(qiáng)環(huán)境競爭力。  

應(yīng)用潛力：  

 

高產(chǎn)乳酸特性具工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。  

 

高氧親和力機(jī)制可為微生物燃料電池設(shè)計(jì)提供參考。  

 

圖示總結(jié)

圖1：系統(tǒng)發(fā)育樹與基因組相似性矩陣（ANI/AAI/isDDH）。  

 

圖2：泛基因組功能分類（核心/附屬/獨(dú)有基因）。  

 

圖4：乳酸產(chǎn)量對比（柱狀圖）。  

 

圖5：底物親和力熱圖（Km(app)對比）。  

 

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注：所有數(shù)據(jù)均嚴(yán)格引用文檔中的圖表編號，未添加虛構(gòu)內(nèi)容。