A collagen-based layered chronic wound biofilm model for testing antimicrobial wound products

用于測(cè)試抗菌傷口產(chǎn)品的基于膠原蛋白的分層慢性傷口生物膜模型

來(lái)源：Wound Repair and Regeneration,2023,DOI:10.1111/wrr.13087

 

摘要概述

 

這篇論文開(kāi)發(fā)了一種改進(jìn)的體外慢性傷口生物膜模型（mCWB），旨在更真實(shí)地模擬人類(lèi)慢性傷口的微環(huán)境。核心創(chuàng)新包括：用哺乳動(dòng)物膠原替代植物源瓊脂作為基質(zhì)；通過(guò)Transwell插入裝置實(shí)現(xiàn)傷口模擬培養(yǎng)基的動(dòng)態(tài)營(yíng)養(yǎng)交換；接種金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）形成雙菌種生物膜。模型在33°C下培養(yǎng)，模擬傷口溫度。測(cè)試了三種含活性有機(jī)酸的可降解淀粉水凝膠（Hydrogel A/B/C）及2%洗必泰（CHX）對(duì)照。結(jié)果顯示，水凝膠顯著降低菌落數(shù)（CFU），逆轉(zhuǎn)堿性pH至酸性環(huán)境，并緩解氧氣消耗，效果優(yōu)于洗必泰。模型成功模擬了慢性傷口的缺氧、高pH和多菌種共存特征。

 

研究目的

 

研究旨在創(chuàng)建一個(gè)“理想”的體外慢性傷口感染模型，滿足8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：基于哺乳動(dòng)物材料（膠原）；持續(xù)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)（無(wú)剪切流）；支持多菌種生長(zhǎng)；表達(dá)三維梯度（氧氣、pH、營(yíng)養(yǎng)）；無(wú)固體表面附著；無(wú)植物源成分；經(jīng)濟(jì)且可重復(fù)。目標(biāo)是為抗生物膜療法提供更可靠的測(cè)試平臺(tái)，減少實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)與臨床效果的差距。例如，慢性傷口常因細(xì)菌生物膜和微環(huán)境異常（如pH>8.0）而難以愈合，現(xiàn)有模型無(wú)法充分模擬這些特征。

 

研究思路

 

研究采用分層改進(jìn)策略。首先，優(yōu)化原始慢性傷口生物膜模型（CWB）：將瓊脂基質(zhì)替換為膠原（2 mg/mL），添加生理鹽水緩沖液（PBS），并在Transwell插入裝置中構(gòu)建兩層結(jié)構(gòu)——真皮層（含血清、血液、膠原）和脂肪層（含豬脂肪、膠原）。雙菌種接種：銅綠假單胞菌加入下層，金黃色葡萄球菌加入上層，初始菌量為100-200 CFU。模型置于傷口模擬培養(yǎng)基中，每24小時(shí)更換培養(yǎng)基以模擬營(yíng)養(yǎng)動(dòng)態(tài)輸入。其次，測(cè)試抗菌產(chǎn)品：水凝膠（pH 2.2–2.5）和洗必泰（pH 5.9）單次或重復(fù)（2×2天）應(yīng)用于模型表面。評(píng)估包括菌落計(jì)數(shù)、pH/氧氣微梯度測(cè)量（使用丹麥Unisense微電極）和共聚焦顯微鏡成像。整個(gè)流程在6天內(nèi)完成，覆蓋基線、治療中和治療后階段。

 

測(cè)量數(shù)據(jù)及意義

 

研究系統(tǒng)測(cè)量了三個(gè)維度的數(shù)據(jù)，以驗(yàn)證模型有效性和治療作用：

菌落數(shù)（CFU）：數(shù)據(jù)來(lái)自圖3和表2-3。圖3顯示未處理mCWB模型中雙菌種數(shù)量穩(wěn)定（6天內(nèi)S.aureus CFU維持~8.5 log??/mL，P.aeruginosa~9.6 log??/mL），比例從初始平衡增至20:1（P.aeruginosa主導(dǎo)），而原始CWB模型中S.aureus被競(jìng)爭(zhēng)抑制。表2-3證實(shí)水凝膠（如Hydrogel A）使CFU降低4–6 log??（P.aeruginosa更敏感），洗必泰僅抑制1.4–1.9 log??。意義在于：CFU穩(wěn)定性證明mCWB能長(zhǎng)期維持多菌種共存，模擬真實(shí)傷口菌群動(dòng)態(tài)；治療數(shù)據(jù)揭示水凝膠的強(qiáng)效殺菌作用，而洗必泰的局限性提示其臨床適用性不足。

 

pH和氧氣梯度：數(shù)據(jù)來(lái)自圖4、圖5和圖6。

 

 

圖4顯示未處理模型pH升至>8.0（mCWB更持久），氧氣通量率升高至~13.6 nmol O?cm?2min?1（表示細(xì)菌呼吸導(dǎo)致缺氧）。圖5-6中，水凝膠將pH降至3.1–4.6（例如Hydrogel B pH=3.1），氧氣梯度恢復(fù)至基線（滲透深度>1 mm），洗必泰僅輕微改善pH（~7.3）和氧氣梯度。意義在于：高pH和缺氧是慢性傷口非愈合的關(guān)鍵標(biāo)志，水凝膠通過(guò)酸化逆轉(zhuǎn)微環(huán)境，支持組織修復(fù)（低pH促血管生成和免疫反應(yīng)），而氧氣恢復(fù)表明代謝負(fù)擔(dān)減輕。

 

生物膜結(jié)構(gòu)：數(shù)據(jù)來(lái)自圖7和圖8。

 

 

圖7顯示原始CWB模型中S.aureus形成微菌落但被P.aeruginosa抑制，死亡菌體聚集。圖8中mCWB模型（如day 4）顯示雙菌種形成大型生物膜聚集體和微菌落，S.aureus分布更深（至脂肪層）。意義在于：證實(shí)模型支持復(fù)雜生物膜發(fā)育（如菌種空間分層），模擬臨床傷口中菌群的異質(zhì)性和耐受機(jī)制，為抗生物膜策略提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

 

丹麥Unisense微電極數(shù)據(jù)的特殊意義

 

研究使用Unisense微電極（型號(hào)OX-25氧電極，尖端25μm；PH-100 pH電極，尖端100μm）測(cè)量模型內(nèi)部微梯度。電極以100μm步進(jìn)垂直掃描（深度至1100μm），數(shù)據(jù)如圖4-6所示。關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)包括：未處理模型中，氧氣在0.4 mm深度耗盡（圖6），形成陡峭梯度（通量率>13 nmol O?cm?2min?1），pH均勻升至>8.0（圖4）；水凝膠治療后，氧氣滲透深度恢復(fù)至>1 mm（圖5），pH降至3.1–4.6。研究意義在于：首次在體外模型中量化微米級(jí)生化梯度，證明細(xì)菌呼吸是傷口缺氧的核心驅(qū)動(dòng)（氧通量計(jì)算基于Fick擴(kuò)散定律）；數(shù)據(jù)揭示有效治療需同時(shí)靶向菌載量和微環(huán)境（如酸化改善愈合條件），而洗必泰僅部分抑制代謝（氧氣消耗減少但CFU未顯著降），突顯其臨床缺陷。這種高分辨率測(cè)量為傷口病理機(jī)制提供直接證據(jù)，推動(dòng)靶向微環(huán)境的療法開(kāi)發(fā)。

 

核心結(jié)論

 

mCWB模型成功模擬慢性傷口特征：雙菌種穩(wěn)定共存（P.aeruginosa:S.aureus≈20:1）、堿性pH（>8.0）和缺氧梯度（淺表富氧/深層無(wú)氧）。酸性水凝膠通過(guò)三重機(jī)制起效：直接殺菌（CFU降低4–6 log??）、逆轉(zhuǎn)pH至促愈合酸性狀態(tài)、緩解氧氣消耗。洗必泰效果有限，僅輕微抑制P.aeruginosa。該模型為抗生物膜藥物篩選提供高效平臺(tái)，強(qiáng)調(diào)微環(huán)境改善與菌載控制同等重要。