標題：Diel Fluctuation of Extracellular Reactive Oxygen Species Production in the Rhizosphere of Rice

 

水稻根際細胞外活性氧產生的晝夜波動

 

來源：Environmental Science&Technology,2022,56,9075-9082.doi:10.1021/acs.est.2c00005

 

摘要內容

 

摘要首次報道了水稻根際存在晝夜波動（diel fluctuation）的胞外活性氧（ROS）生成現象。通過微流控芯片結合共聚焦顯微鏡，研究實現了水稻根際ROS的原位可視化觀測，發現根際是ROS生成的"熱點區域"，羥基自由基（·OH）濃度可達10??M，與水生系統中的光化學途徑相當。ROS生成與溶解氧（DO）、氧化還原電位（Eh）和pH同步波動，且受根系徑向氧釋放（ROL）驅動。微生物呼吸釋放的胞外電子與根系分泌的氧氣相互作用是ROS生成的核心機制，其中鐵礦物和有機質在電子傳遞中起關鍵作用。這一發現對根際污染物轉化和元素循環具有深遠影響。

 

研究目的

 

研究旨在：

 

1.驗證根際ROS生成：通過原位成像技術確認水稻根際是否存在胞外ROS生成；

 

2.量化晝夜波動規律：解析ROS生成與光暗周期的關聯性及其驅動因素；

 

3.闡明生成機制：揭示微生物-根系-電子穿梭體（如礦物/有機質）的協同作用機制；

 

4.評估環境效應：探究ROS對污染物降解（如四環素）和微生物群落的影響。

 

研究思路

 

研究采用"原位觀測-機制驗證-環境效應"三步策略：

 

1.原位可視化：設計微流控芯片模擬根際環境，結合H?DCFDA熒光探針和共聚焦顯微鏡，實現ROS空間分布（根表徑向梯度）和時間動態（秒級響應）的原位捕捉。

 

2.晝夜監測：使用丹麥Unisense微電極（OXY25、ROX-N、pH-N）同步監測DO、Eh、pH，結合TPA化學探針定量·OH，分析光暗周期（12小時光照/12小時黑暗）下的波動規律。

 

3.機制驗證：通過滅菌實驗、添加電子穿梭體（AQDS/金屬離子，圖3e-f）及自然土壤驗證，明確微生物、有機質和礦物的調控作用。

 

4.環境效應：分析ROS對四環素降解和微生物群落組成的影響。

 

測量的數據及其研究意義

 

研究測量了多維度數據，每項數據均來自文檔中的圖表，其研究意義如下：

 

ROS空間分布（圖1b）：根表附近熒光強度最高（綠色熱點），隨距離增加呈梯度下降。意義：首次可視化根際ROS的"熱點"分布，證實根表是氧化還原反應的核心界面。

ROS晝夜波動（圖2a）：·OH生成速率白天達40 nM/min，夜間<10 nM/min，光照后快速升高（延遲時間<1小時）。意義：揭示ROS生成受光周期調控，打破"ROS僅存于光照區"的傳統認知。

 

根際微環境參數（圖2b-d）：DO（25→210μmol/L）、Eh（0.32→0.53 V）和pH（5.4→5.8）與ROS同步波動，光照后DO上升滯后于ROS。意義：證實ROL是核心驅動力，ROS生成優先消耗氧氣（DO滯后現象）。

 

微生物依賴性（圖3d）：滅菌根際ROS生成降低90%（p<0.01），添加土壤微生物后部分恢復。意義：證實微生物呼吸是電子源，不可或缺。

 

電子穿梭體效應（圖3e-f）：添加AQDS（有機質類似物）和過渡金屬（Fe2?/Mn2?）使ROS提升103.4–118.4%。意義：有機質/礦物作為"電子倉庫"和"穿梭體"，加速電子向O?傳遞。

 

自然土壤驗證（圖4b）：根際·OH濃度白天>2000 nM，夜間<400 nM。意義：排除芯片模擬偏差，證實自然環境中ROS晝夜波動的普適性。

 

污染物降解（圖5a）：ROS導致四環素羥基化產物生成（質譜鑒定）。意義：為根際污染物原位降解提供新機制。

 

微生物群落影響（圖5b）：ROS抑制Geobacter（鐵還原菌），促進Azospirillum（固氮菌）和Desulfovibrio（硫氧化菌）。意義：揭示ROS通過調控功能菌群，間接驅動碳/氮/硫循環。

 

丹麥Unisense微電極測量數據的詳細解讀

 

研究使用丹麥Unisense微電極系統（OXY25、ROX-N、pH-N）實現根際多參數同步監測，其核心研究意義如下：

 

高時空分辨率動態關聯：微電極以5分鐘間隔連續監測DO、Eh、pH（圖2b-d），發現三者與ROS生成嚴格同步（R2>0.93）。光照后DO上升滯后于ROS的現象，首次證明ROS生成優先消耗氧氣（O?→O??→H?O?→·OH），而傳統ROL理論未涵蓋此路徑。

 

 

晝夜波動機制驗證：DO晝夜波動幅度（25→210μmol/L）與ROS完全匹配（圖2a-b），證實光照→光合作用→ROL→O?供應→ROS生成的因果鏈。Eh升高（0.32→0.53 V）進一步驗證根際氧化態增強是ROS生成的前提。

 

技術優勢：Unisense微電極的微米級探頭（尖端直徑≤100μm）可插入根際微區而不擾動根-土界面，克服了傳統電極的空間局限。其耐低氧環境（檢出限0.2μmol/L）和快速響應（<2秒）特性，為還原性根際環境監測提供理想工具。

 

結論

 

研究得出以下核心結論：

 

1.根際是ROS新熱點：水稻根際存在顯著胞外ROS生成（·OH達10??M），濃度與水生光化學途徑相當，且具晝夜波動性（晝高夜低）。

 

2.ROL-微生物協同機制：根系釋氧（ROL）與微生物呼吸釋放的胞外電子經有機質/礦物穿梭，共同驅動ROS生成（圖3a）。

 

3.多參數同步波動：DO、Eh、pH與ROS嚴格同步波動，證實光合作用是原始驅動力（圖2）。

 

4.環境效應：ROS促進污染物降解（如四環素羥基化），并通過抑制Geobacter、促進Azospirillum等調控微生物群落（圖5），進而影響碳氮硫循環。