Ammonia oxidation at pH 2.5 by a new gammaproteobacterial ammonia-oxidizing bacterium

在 pH 2.5 下，一種新的 γ 形細菌氨氧化細菌進行氨氧化

來源：The ISME Journal (2021) 15:1150–1164

 

一、摘要概述

 

本研究報道了從酸性空氣生物濾池中富集培養(yǎng)出一種新型γ-變形菌門氨氧化細菌（AOB），命名為 “Candidatus Nitrosacidococcus tergens” sp. RJ19。該菌在 pH 2.5 的極端酸性條件下仍能生長并氧化氨（NH?），是迄今發(fā)現(xiàn)的最耐酸氨氧化微生物。其關鍵特性包括：

 

代謝特性：化能自養(yǎng)型，以氨為能源，尿素為替代底物。

生長參數(shù)：氨為底物時生長率0.196 d?1（倍增時間3.5天）；尿素為底物時生長率0.104 d?1（倍增時間6.7天）。

適應性機制：超高氨親和力（表觀Km=147±14 nM NH?）、強耐NO毒性、獨特的膜系統(tǒng)結構。

基因組特征：1.81 Mb環(huán)狀基因組，含氨單加氧酶（amoCAB）、羥胺氧化還原酶（hao）、脲酶（ure）等關鍵基因，但缺乏經典TCA循環(huán)和亞硝酸還原酶（nirK）。

 

二、研究目的

 

挑戰(zhàn)傳統(tǒng)認知：驗證氨氧化在pH<3的可行性（此前認為pH<4時NH?質子化導致底物不可用）。

揭示新菌生理機制：闡明極端酸性條件下氨氧化的能量獲取、底物利用及環(huán)境適應性策略。

解析生態(tài)功能：解釋酸性環(huán)境（如豬場生物濾池）中氮循環(huán)的微生物驅動機制。

 

三、研究思路

 

采用 “原位采樣→富集培養(yǎng)→多組學整合” 策略：

 

樣品來源：荷蘭Erp豬場生物濾池生物膜（pH 2-3）。

富集培養(yǎng)：

連續(xù)膜生物反應器（pH 3.5），以NH?Cl或尿素為底物。

監(jiān)測底物消耗、產物生成及生物量變化（表1）。

生理表征：

氨氧化動力學（Unisense氧微電極監(jiān)測耗氧速率）。

pH生長范圍測試（pH 2.5-7）。

組學分析：

基因組：組裝注釋（MicroScope平臺），鑒定代謝通路。

轉錄組：比較NH?? vs. 尿素培養(yǎng)下的基因表達差異。

形態(tài)觀察：電鏡（TEM）與熒光原位雜交（FISH）分析細胞結構。

 

四、關鍵數(shù)據(jù)及研究意義

1. 氨氧化動力學（Unisense微電極數(shù)據(jù)）

 

數(shù)據(jù)來源：Unisense RC350氧微電極（圖2相關實驗）。

 

方法：向呼吸室注入NH?Cl，實時監(jiān)測耗氧速率（圖2）。

結果：

表觀Km=147±14 nM NH?（pH 4.7），Vmax=0.28±0.01 μM O? min?1 μg蛋白?1。

意義：

超高底物親和力：解釋菌株在低NH?濃度酸性環(huán)境中的競爭優(yōu)勢（Km值低于多數(shù)AOA/Comammox）。

代謝效率量化：為酸性生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)模型提供參數(shù)。

 

2. pH適應性（圖3）

 

結果：活性pH范圍2.5–7，最適pH 6。

意義：證實菌株廣酸適應性，推翻“氨氧化限于pH>5.5”的傳統(tǒng)觀點。

 

3. 尿素利用（圖4，表1）

 

 

結果：尿素代謝基因（ure）表達上調，但生長率僅為氨氧化的50%。

意義：揭示尿素作為替代氮源的可行性，但效率受限可能因缺乏高效氨轉運體（AmtB）。

 

4. 形態(tài)與超微結構（圖5）

 

 

結果：

球狀細胞（直徑0.5 μm），胞內膜堆疊（推測為AMO酶位點）。

EPS層包裹細胞聚集體（抗酸屏障）。

意義：膜系統(tǒng)結構與酸耐受性相關，EPS或抵御質子滲透。

 

5. 轉錄組分析（圖6）

 

結果：

NH??培養(yǎng)：amoCAB、norB（NO還原酶）高表達。

尿素培養(yǎng)：脲酶基因（ure）及NH??透酶基因（NSCAC_1037）上調。

意義：證實底物依賴的代謝調控，norB高表達關聯(lián)NO解毒（酸性下NO毒性增強）。

 

五、核心結論

 

新分類單元：“Ca. Nitrosacidococcus tergens”為γ-變形菌門新屬新種，是迄今最耐酸AOB（pH 2.5）。

代謝創(chuàng)新：

通過超高氨親和力（Km=147 nM）克服酸性環(huán)境底物限制。

尿素代謝提供替代路徑，但效率低于直接氨氧化。

生態(tài)啟示：

酸性生境（如農業(yè)廢水處理系統(tǒng)）存在活躍的氨氧化過程。

菌株的NO耐受與解毒機制（norB）是酸性硝化系統(tǒng)的關鍵適應性特征。

 

六、Unisense電極數(shù)據(jù)的深度解讀

1. 技術原理

 

電極型號：Unisense RC350氧微電極（Clark型）。

工作原理：通過O?在鉑陰極的還原反應實時監(jiān)測溶解氧濃度變化（靈敏度μM級）。

 

2. 實驗設計創(chuàng)新

 

動態(tài)監(jiān)測：向密閉呼吸室注入NH?Cl，同步記錄耗氧速率（圖2B）。

控溫攪拌：22°C恒溫，500 rpm攪拌確保反應均一性。

三重驗證：獨立生物重復+蛋白定量校正（BCA法）。

 

3. 研究意義

 

挑戰(zhàn)酶學極限：測得Km值接近海洋AOA（如Nitrosopumilus），顛覆“酸性環(huán)境氨氧化低效”認知。

揭示生態(tài)位策略：超高Km值表明菌株專化于低NH?生境，避免與中性pH菌競爭。

指導工程應用：為酸性廢水生物處理工藝優(yōu)化提供動力學參數(shù)（如生物濾池設計）。

 

圖表示例說明

 

圖2：氨氧化活性與底物消耗動力學（Unisense數(shù)據(jù)）。

圖3：pH生長范圍及最適pH（柱狀圖）。

圖4：尿素代謝動態(tài)（底物消耗與產物積累曲線）。

圖5：細胞超微結構（TEM顯示膜堆疊與EPS）。

圖6：轉錄組熱圖（NH?? vs. 尿素培養(yǎng)差異基因）。

 

總結：本研究通過創(chuàng)新性地整合Unisense微電極技術與多組學，揭示了極端酸性環(huán)境氨氧化的微生物機制，為酸性廢水處理及氮循環(huán)模型提供了新范式。