A Complex Interplay between Nitric Oxide, Quorum Sensing, and the Unique Secondary Metabolite Tundrenone Constitutes the Hypoxia Response in Methylobacter  

一氧化氮、群體感應(yīng)和獨(dú)特次級(jí)代謝產(chǎn)物Tundrenone之間的復(fù)雜相互作用構(gòu)成了甲基桿菌的低氧應(yīng)激反應(yīng)  

來(lái)源：mSystems, volume 5, issue 1, e00770-19, January 2020  

《mSystems》第5卷第1期，文章編號(hào)e00770-19，2020年1月

 

摘要內(nèi)容

該研究揭示了甲基桿菌（Methylobacter）應(yīng)對(duì)低氧環(huán)境的一種新穎且復(fù)雜的應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室操作和比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)編碼雜交簇蛋白（Hcp）及其感應(yīng)調(diào)控功能的基因簇在低氧條件下被顯著誘導(dǎo)。突變分析表明該基因簇參與低氧應(yīng)激反應(yīng)。進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析揭示了NO介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)、群體感應(yīng)、次級(jí)代謝產(chǎn)物tundrenone和甲醇脫氫酶功能之間存在復(fù)雜的相互聯(lián)系。這一獨(dú)特的低氧應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)可能解釋了甲基桿菌在環(huán)境中的適應(yīng)能力及其廣泛的分布。  

 

研究目的

探究甲基桿菌屬物種應(yīng)對(duì)低氧環(huán)境的分子機(jī)制，特別是闡明其如何通過(guò)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在低氧條件下維持生存和代謝活性。  

 

研究思路：  

1 通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，對(duì)比在高氧分壓和低氧條件下培養(yǎng)的甲基桿菌的基因表達(dá)差異，識(shí)別低氧應(yīng)激相關(guān)基因簇。  

2 構(gòu)建關(guān)鍵基因（如hcp、hcr、nasA等）的敲除突變體，分析其在低氧條件下的表型變化。  

3 利用微傳感器實(shí)時(shí)測(cè)量溶解氧、NO和N?O的濃度動(dòng)態(tài)變化，驗(yàn)證基因功能。  

4 通過(guò)多組轉(zhuǎn)錄組學(xué)實(shí)驗(yàn)（比較野生型與突變體在不同氮源和氧條件下的基因表達(dá)），揭示NO、群體感應(yīng)和tundrenone之間的調(diào)控關(guān)系。  

5 整合數(shù)據(jù)，構(gòu)建低氧應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型。  

 

測(cè)量的數(shù)據(jù)：  

1 基因表達(dá)數(shù)據(jù)（轉(zhuǎn)錄組學(xué)）：通過(guò)RNA測(cè)序獲得不同處理下的全基因組表達(dá)譜（圖1,4,5,6）。  

 

 

 

 

2 生長(zhǎng)曲線和存活率：監(jiān)測(cè)野生型和突變體在低氧條件下的生長(zhǎng)和存活情況。  

3 溶解氣體濃度（O?、NO、N?O）：使用Unisense微傳感器實(shí)時(shí)測(cè)量（圖3）。  

 

4 細(xì)胞存活/死亡比例：通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合Live/Dead染色評(píng)估。  

5 應(yīng)激反應(yīng)表型：評(píng)估突變體對(duì)氧化應(yīng)激（H?O?、paraquat）和亞硝化應(yīng)激（DETA-NO）的耐受性。  

 

這些數(shù)據(jù)的研究意義：  

1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)揭示了低氧應(yīng)激的核心基因簇（hcp-hcr）和全局轉(zhuǎn)錄重編程，證明了低氧響應(yīng)的高度復(fù)雜性（圖1,4,5,6）。  

2 突變體表型分析證實(shí)了Hcp/Hcr系統(tǒng)在NO還原和低氧存活中的關(guān)鍵作用，以及NasA在硝酸鹽同化中的必要性。  

3 氣體測(cè)量數(shù)據(jù)直接證明了Hcp/Hcr的NO還原酶功能，并顯示NasA突變體因NO積累導(dǎo)致快速死亡（圖3）。  

4 多條件轉(zhuǎn)錄組比較揭示了NO濃度依賴的調(diào)控作用，以及群體感應(yīng)和tundrenone對(duì)低氧響應(yīng)的調(diào)制（圖5,6）。  

5 整體數(shù)據(jù)闡明了一種整合了核心代謝、反硝化、群體感應(yīng)和次級(jí)代謝的獨(dú)特低氧適應(yīng)策略。  

 

使用丹麥Unisense電極測(cè)量出來(lái)的數(shù)據(jù)的研究意義：  

使用丹麥Unisense微傳感器測(cè)量的溶解O?、NO和N?O數(shù)據(jù)（圖3）提供了實(shí)時(shí)、原位的氣體動(dòng)力學(xué)證據(jù)，對(duì)驗(yàn)證假設(shè)和機(jī)制至關(guān)重要。具體意義包括：  

1 直接證明NO積累與毒性的關(guān)系：NasA突變體在硝酸鹽培養(yǎng)基中立即產(chǎn)生高濃度NO（圖3B），與其快速死亡表型一致，證實(shí)了硝酸鹽同化缺陷導(dǎo)致NO毒性。  

2 驗(yàn)證Hcp/Hcr的NO還原功能：野生型在低氧后期才積累NO和N?O，且伴隨N?O峰值，表明Hcp將NO還原為N?O；而Hcp突變體在好氧下就積累NO且不產(chǎn)生N?O，直接證明Hcp是主要的NO還原酶。  

3 揭示低氧響應(yīng)的時(shí)序性：氣體動(dòng)態(tài)顯示NO信號(hào)僅在低氧后期出現(xiàn)（野生型>10小時(shí)），表明NO是低氧應(yīng)激的次級(jí)信號(hào)而非初始觸發(fā)器。  

4 支持NO的雙重角色：低濃度NO可能作為信號(hào)分子（調(diào)控基因表達(dá)），而高濃度則有毒害作用，這一濃度依賴效應(yīng)通過(guò)實(shí)時(shí)測(cè)量得以體現(xiàn)。  

5 提供生理相關(guān)數(shù)據(jù)：微傳感器的原位測(cè)量避免了采樣干擾，提供了更接近自然條件的生理數(shù)據(jù)，增強(qiáng)了結(jié)果的生物學(xué)相關(guān)性。  

 

結(jié)論：  

1 甲基桿菌的低氧應(yīng)激反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)，涉及Hcp/Hcr介導(dǎo)的NO還原、群體感應(yīng)（QS）、次級(jí)代謝產(chǎn)物tundrenone以及甲醇脫氫酶功能的調(diào)控。  

2 Hcp/Hcr作為高親和力NO還原酶，是低氧存活的關(guān)鍵，其表達(dá)受NorR調(diào)控且與QS/Tun系統(tǒng)存在互斥調(diào)控關(guān)系。  

3 NO既是毒性分子也是信號(hào)分子，其濃度依賴性地調(diào)控包括QS、tundrenone合成和甲醇氧化在內(nèi)的多個(gè)通路。  

4 群體感應(yīng)和tundrenone參與低氧響應(yīng)，其缺失突變體表現(xiàn)出低氧響應(yīng)缺陷，表明它們與Hcp/Hcr系統(tǒng)功能交織。  

5 這種復(fù)雜的低氧適應(yīng)策略可能是甲基桿菌在氧梯度環(huán)境中保持競(jìng)爭(zhēng)力和廣泛分布的重要原因。