Denitrification characterization of dissolved oxygen microprofiles in lake surface sediment through analyzing abundance, expression, community composition and enzymatic activities of denitrifier functional genes

基于反硝化功能基因豐度、表達、群落組成和酶活性分析湖泊表層沉積物溶解氧微剖面的反硝化特性

來源：Hong et al. AMB Expr (2019) 9:129

 

論文摘要

本研究通過響應面法（RSM） 優化了湖泊表層沉積物的反硝化條件，并基于溶解氧（DO）濃度將沉積物微層劃分為好氧層（AEZ）、缺氧層（HYZ）、上部厭氧層（ANZ-1）和下部厭氧層（ANZ-2）。利用定制亞毫米級采樣裝置結合qPCR、高通量測序和酶活性分析，系統研究了不同DO層中反硝化菌的豐度、基因表達、群落組成和酶活性特征。結果表明，反硝化特性在不同DO層間存在顯著差異：好氧層中norB、缺氧層中nirS、上部厭氧層中nosZ的DNA豐度和RNA表達水平最高。缺氧層和上部厭氧層是氮去除的活躍區域，其功能基因的豐度、表達和酶活性均最高。主要反硝化菌（如Azoarcus、Pseudogulbenkiania、Rhizobium）的豐度在不同層間差異顯著。環境因子（如TOC、TN、NH??-N、NO??-N）與反硝化基因豐度和表達顯著相關。此外，好氧和缺氧層中napA的豐度和表達較高，表明好氧反硝化菌在這些層中可能起重要作用。

研究目的

 

優化反硝化條件：利用響應面法（RSM）確定溫度、pH和鋸屑含量對沉積物反硝化效率（硝酸鹽去除率）的最佳組合。

解析反硝化菌的垂直分布特征：在亞毫米尺度上探究不同DO層（AEZ、HYZ、ANZ-1、ANZ-2）中反硝化菌的DNA豐度、RNA表達、酶活性和群落結構的差異。

揭示環境驅動機制：分析沉積物理化因子（如TOC、TN、氮形態）與反硝化過程的關聯，闡明不同DO層中反硝化菌的響應策略。

 

評估好氧反硝化潛力：通過napA基因的分布，探討好氧反硝化在湖泊沉積物氮循環中的貢獻。

 

研究思路

研究采用“條件優化-分層采樣-多組學整合-機制驗證”的思路：

 

反硝化條件優化：采用Box-Behnken設計（BBD）和RSM，測試溫度（5°C、15°C、25°C）、pH（5.5、7.0、8.5）和鋸屑含量（0.1、0.3、0.5 mg/110 g沉積物）對硝酸鹽去除率的影響，確定最佳條件（25°C、pH 8.5、鋸屑0.5 mg/110 g）。

微環境分層與采樣：使用定制裝置堆疊微孔板模擬沉積物柱，通過丹麥Unisense氧微電極測定DO垂直剖面（圖1b），據此劃分4個DO層（AEZ: 0-1.8 mm, DO 0.2-5.9 mg/L; HYZ: 1.8-2.2 mm, DO 0-0.2 mg/L; ANZ-1: 2.2-2.6 mm, DO 0 mg/L; ANZ-2: 2.6-3.0 mm, DO 0 mg/L）。在最佳條件下培養5天后，分層采集沉積物樣品。

 

多維度數據分析：

 

理化參數：測定NH??-N、NO??-N、NO??-N、TOC、TN（附加文件表S6）。

分子生物學分析：通過qPCR定量反硝化功能基因（narG、napA、nirS、nirK、norB、nosZ）的DNA豐度和RNA表達水平（圖3）；通過Illumina MiSeq測序分析nirS、nirK、nosZ的群落結構（圖4）。

 

 

 

酶活性檢測：測定硝酸鹽還原酶（NAR）、亞硝酸鹽還原酶（NIR）、氧化亞氮還原酶（NOS）的活性和電子傳輸系統（ETS）活性。

 

統計與機制驗證：采用ANOVA、Pearson相關分析（圖4d）和ANOSIM，揭示環境因子與反硝化特性的關系，評估各層的氮去除功能。

 

測量數據及其研究意義（注明來源）

研究測量了多維度數據，其意義和來源如下：

 

硝酸鹽去除率及其優化曲面：

 

意義：RSM分析表明溫度、鋸屑含量和pH共同影響反硝化效率，最佳條件為25°C、pH 8.5、鋸屑0.5 mg/110 g。溫度影響最大，鋸屑次之，證實有機碳和溫度是反硝化的關鍵驅動因子。

 

來源：數據見圖2及附加文件表S2、S4。

 

反硝化功能基因的DNA豐度與RNA表達水平：

 

意義：不同DO層優勢基因不同（AEZ: norB; HYZ: nirS; ANZ-1: nosZ），表明反硝化路徑的空間分異。RNA表達在HYZ和ANZ-1層最高，提示這兩層是活性氮去除熱點。napA在好氧/缺氧層高表達，指示好氧反硝化潛力。

 

來源：數據見圖3a、b。

 

反硝化酶活性（NAR、NIR、NOS）與ETS活性：

 

意義：NIR和NOS活性在HYZ和ANZ-1層最高，與基因表達一致，證實這些層的完整反硝化功能（NO??→N?）。ETS活性在深層（ANZ-2）降低，反映微生物代謝活性隨深度下降。

 

來源：數據見圖3b及正文結果部分。

 

反硝化菌群落結構：

 

意義：nirS型以Azoarcus為主，nirK型以Rhizobium為主，nosZ型以Pseudogulbenkiania為主。群落結構在垂直層間差異顯著（ANOSIM, R2=0.35-0.67），表明DO梯度是群落分化的關鍵選擇壓力。

 

來源：數據見圖4a-c及附加文件表S5。

 

環境因子與反硝化的相關性：

 

意義：NH??-N、NO??-N和TOC與反硝化基因豐度/表達顯著正相關（圖4d），證實氮源和有機碳是反硝化的主要限制因子。不同基因對環境因子的響應差異暗示功能冗余與生態位分化。

 

來源：數據見圖4d及附加文件表S6。

 

研究結論

 

最佳反硝化條件：溫度25°C、pH 8.5、有機碳（鋸屑）0.5 mg/110 g沉積物可實現最高硝酸鹽去除率。

垂直分層效應：反硝化菌的豐度、表達和活性具有明顯的垂直分帶性：好氧層（AEZ）以norB為標志，缺氧層（HYZ）以nirS為標志，上部厭氧層（ANZ-1）以nosZ為標志。HYZ和ANZ-1層是氮去除最活躍的區域。

群落與環境耦合：反硝化菌群落結構受DO梯度強烈篩選，環境因子（TOC、氮形態）與反硝化過程顯著相關，尤其驅動了HYZ和ANZ-1層的高活性。

 

好氧反硝化作用：napA在好氧/缺氧層的高表達表明好氧反硝化菌可能對氮去除有重要貢獻，挑戰了傳統厭氧反硝化的認知。

 

使用丹麥Unisense電極測量數據的研究意義詳細解讀

在本研究中，丹麥Unisense公司的氧微電極系統被用于原位測量沉積物柱的溶解氧（DO）垂直微剖面（方法部分2.3，數據見圖1b），這是劃分沉積物微層和解釋反硝化空間分異的基石。

詳細研究意義如下：

 

實現亞毫米級環境分層：Unisense微電極具有微米級空間分辨率，能夠精確測定沉積物-水界面的DO濃度梯度。本研究利用該技術將僅3 mm厚的表層沉積物劃分為4個功能迥異的DO層（AEZ、HYZ、ANZ-1、ANZ-2）。沒有這種高精度測量，如此細微的生態位分異和后續的生物學分析將無法實現。

為反硝化熱點的識別提供直接證據：DO剖面（圖1b）顯示，HYZ層（1.8-2.2 mm）的DO急劇降至0.2 mg/L以下，而ANZ-1層（2.2-2.6 mm）的DO為0。這為解釋為何HYZ和ANZ-1層出現反硝化基因（nirS、nosZ）表達和酶活性峰值提供了關鍵環境背景：HYZ的低氧條件激活了厭氧反硝化，而ANZ-1的嚴格厭氧環境確保了反硝化鏈的完成（N?O→N?）。

支撐“好氧反硝化”的新發現：在AEZ層（DO 0.2-5.9 mg/L），napA基因的高表達（圖3b）表明好氧反硝化過程的存在。Unisense數據直接證實了該層的有氧狀態，挑戰了“反硝化必須嚴格厭氧”的傳統認知，為研究湖泊沉積物中好氧反硝化菌的生態功能提供了新的視角。

 

技術優勢賦能機制解析：Unisense微電極的原位、無損測量避免了采樣擾動，捕獲了真實的DO梯度。其高分辨率使得在毫米尺度上關聯“物理環境（DO）-微生物功能（基因表達）-生化過程（酶活性）”成為可能，極大地增強了對反硝化微觀機制的理解。

 

綜上所述，Unisense氧微電極獲得的數據是本研究的核心支撐。它不僅是簡單測量DO濃度，更是定義研究尺度、解析過程機制、發現新現象的關鍵工具，使研究者能夠將反硝化生物學響應與微環境化學梯度精確耦合，最終得出具有高度空間分辨率的結論。