Low yield and abiotic origin of N2O formed by the complete nitrifier Nitrospira inopinata

由完全硝化劑 Nitrospira inopinata 形成的 N2O 的低產和非生物來源

來源：Nature Communications（2019年，第10卷）

 

論文總結

研究通過綜合運用微生物生理學、基因組學和同位素技術，探究了完全氨氧化細菌（comammox）Nitrospira inopinata 產生一氧化氮（NO）和氧化亞氮（N2O）的能力、途徑及產量，并與傳統氨氧化細菌（AOB）和古菌（AOA）進行了比較。以下是對論文的詳細總結。

摘要概括

摘要指出，N2O是一種重要的溫室氣體，微生物硝化作用是其主要來源之一。傳統認為氨氧化細菌（AOB）和古菌（AOA）是N2O的主要生產者，但新發現的完全氨氧化細菌（comammox）的貢獻未知。本研究以純培養的comammox細菌N. inopinata為對象，發現其對NO清除劑敏感、不能反硝化產生N2O，且N2O產量與AOA相當但遠低于AOB。進一步證明其N2O源于羥胺（NH2OH）的非生物轉化，且產量不受氧氣濃度影響。基因組分析表明comammox缺乏NO還原酶（nor基因），無法進行硝化菌反硝化。結果表明comammox在硝化過程中可能比AOB產生更少的N2O，對全球N2O排放的貢獻較小。

研究目的

本研究旨在解決以下核心問題：

 

評估comammox細菌N. inopinata產生NO和N2O的能力及產量。

闡明其NO和N2O產生的途徑（生物 vs. 非生物）。

通過比較基因組學分析comammox的氮代謝基因庫存，揭示其與AOB/AOA的差異。

 

量化不同氧氣條件下N2O的產量，評估環境因素對其排放的影響。

 

研究思路

研究采用多學科方法：

 

比較基因組學：分析N. inopinata及23個comammox宏基因組組裝基因組（MAGs）的氮代謝關鍵基因（如nirK、nor、cytL等），與AOB/AOA對比（Fig. 2）。

 

微呼吸測量：使用丹麥Unisense微電極系統實時監測O2、NO和N2O的瞬時動力學，探究NH3和NO2?氧化過程中的氣體產生與消耗（Fig. 3, 4, 5）。

 

 

 

抑制劑實驗：應用NO清除劑PTIO抑制N. inopinata活性，驗證NO在代謝中的關鍵作用。

批量培養與氣體測量：通過氣相色譜（GC）定量N2O產量，計算N2O/NH3比值，評估缺氧與富氧條件下的差異（Fig. 6）。

 

同位素分析：測定N2O的位點偏好（δ15N-SP），區分生物與非生物來源。

 

非生物控制實驗：驗證熱死細胞及培養基組分對N2O產生的貢獻。

 

測量數據及其研究意義

以下列出關鍵測量數據、其來源（圖編號）及研究意義：

 

基因組庫存數據（來源：Fig. 2）

 

數據：所有comammox基因組（包括N. inopinata）均編碼nirK（亞硝酸鹽還原酶），但完全缺乏norCBQD和norSY（NO還原酶）基因；cytL（P460細胞色素）基因零星分布。

 

研究意義：遺傳證據表明comammox無法通過硝化菌反硝化途徑還原NO至N2O，與AOB形成鮮明對比；nirK存在提示其可能產生NO。

 

微呼吸動力學數據（來源：Fig. 3, 4）

 

數據：NH3氧化時，NO快速升至峰值（~13 nM）后消耗；NO2?氧化時，NO穩定在~45 nM；缺氧時無NO釋放。O2消耗與NO產生耦合。

 

研究意義：證明NO是代謝中間體，但產生量低（較AOB低10倍）；缺氧無NO表明無厭氧呼吸能力；支持NO可能通過未知NO氧化酶（NOO）再氧化。

 

PTIO抑制數據（來源：Supplementary Fig. 5）

 

數據：PTIO對N. inopinata的EC50為18.9 μM（微呼吸）和63.6 μM（批量培養），接近AOA（17.5-18.3 μM）但遠低于AOB（>300 μM）；抑制可逆（低濃度時）。

 

研究意義：NO清除抑制活性，證實NO是代謝關鍵中間體；comammox對PTIO敏感性與AOA相似，提示調控機制類似。

 

N2O產量與同位素數據（來源：Fig. 5, 6）

 

數據：富氧下N2O產量為0.070±0.006%（N2O/NH3）；缺氧下為0.073±0.033%，無顯著差異；δ15N-SP為33.4±0.3‰（富氧）和34.2±1.4‰（缺氧），與NH2OH非生物轉化一致（30.8-35.6‰）。

 

研究意義：N2O產量低且與AOA相當（0.07-0.09%）；產量不隨氧氣變化，與AOB相反（缺氧時增高）；同位素證據支持非生物起源（NH2OH與NO2?反應）。

 

非生物控制數據（方法部分）

 

數據：熱死細胞+NH2OH/NO2?產生0.83±0.1 μM N2O，與活細胞延遲釋放的N2O量吻合。

 

研究意義：直接證明N2O源于胞外NH2OH的化學分解，而非酶促反應；排除生物反硝化貢獻。

 

研究結論

本研究得出以下核心結論：

 

Comammox的N2O產量低：N. inopinata的N2O產量（0.07%）與AOA相當，遠低于AOB（0.095-0.27%），表明其在環境中可能不是主要N2O源。

非生物起源主導：N2O主要來自NH2OH與NO2?的化學反應，而非酶促反硝化；同位素簽名（高δ15N-SP）和缺氧無增量支持此機制。

遺傳缺陷致無反硝化能力：comammox缺乏nor基因，無法進行硝化菌反硝化，與AOB根本不同。

NO為關鍵中間體但嚴格調控：NO由HAO或NirK產生，但產量低且缺氧不積累，提示存在高效NO氧化或消耗途徑。

 

生態意義：Comammox在低氮環境中可能降低N2O排放，但需野外研究驗證；PTIO不能選擇性抑制AOA（comammox同樣敏感）。

 

丹麥Unisense電極測量數據的詳細解讀

在本研究中，丹麥Unisense微電極系統（型號OX-MR、N2O-MR和ami700-NO）用于實時監測微生物呼吸和氣體動力學，其研究意義主要體現在：

 

高分辨率實時監測：Unisense電極提供nM級檢測限（NO檢測限0.25 nM），允許在毫升級反應室中連續追蹤O2、NO和N2O的瞬時變化（如Fig. 3-5）。例如，Fig. 3顯示NO峰值在O2消耗30%時出現，直接證明NO產生與好氧氨氧化耦合。

揭示代謝動態：電極數據捕捉到NO產生與消耗的快速轉換（如Fig. 3中NO峰后下降），提示N. inopinata存在NO氧化機制；而缺氧無NO釋放（對比AOB）證明其無厭氧反硝化能力。

定量動力學參數：通過測量底物添加后的氣體通量，計算表觀速率（如O2消耗率）、親和力（Km）和閾值，為模型提供參數（如Fig. 4中NO2?氧化時NO穩態~45 nM）。

驗證遺傳假設：電極數據與基因組結果一致——無nor基因導致無N2O積累（Fig. 5中N2O傳感器無信號）；PTIO抑制實驗進一步確認NO的代謝中心角色。

技術優勢：Unisense系統的微尺度測量（10 mL反應室）避免頭空間干擾，提供原位溶解氣體濃度；多傳感器同步監測（O2、NO、N2O）確保數據一致性。

 

生態推論：低NO產量（nM級）和N2O缺乏表明comammox在自然環境中可能不貢獻顯著N2O，電極數據為降低排放的策略提供依據。

 

總之，丹麥Unisense電極數據是本研究的實驗核心，通過提供高精度、實時的氣體動力學測量，它直接驗證了comammox的代謝特性（低NO產量、無N2O酶促產生）、揭示了非生物N2O起源，并支撐了其與AOB/AOA的功能差異。這項技術突出了微呼吸測量在微生物生理學研究中的關鍵作用，為理解氮循環微生物的排放貢獻提供了可靠方法。