Low-temperature culturing improves survival rate of tissue-engineered cardiac cell sheets

低溫培養(yǎng)提高組織工程心肌細(xì)胞的存活率

來源：Biochemistry and Biophysics Reports 14 (2018) 89–97

 

論文總結(jié)

研究了低溫培養(yǎng)（20-33.5°C）對三維組織工程心臟細(xì)胞片存活率的影響。通過降低細(xì)胞代謝率，低溫培養(yǎng)改善了高密度心肌組織的存活和血管網(wǎng)絡(luò)形成，為器官工程提供了新策略。以下從摘要、研究目的、研究思路、測量數(shù)據(jù)及意義、結(jié)論等方面進(jìn)行總結(jié)，并詳細(xì)解讀使用丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的研究意義。

一、論文摘要

研究通過細(xì)胞片技術(shù)構(gòu)建三維心臟組織，比較了低溫培養(yǎng)（20-33.5°C）與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)（37°C）對心肌細(xì)胞存活率、代謝和血管網(wǎng)絡(luò)形成的影響。結(jié)果表明，低溫培養(yǎng)（尤其是30°C）能顯著降低細(xì)胞代謝（如葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生），減少細(xì)胞死亡，并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞形成前血管網(wǎng)絡(luò)。移植實(shí)驗證實(shí)，低溫處理的細(xì)胞片在裸鼠體內(nèi)具有更好的存活率和功能整合。研究提出低溫培養(yǎng)作為一種簡單有效的方法，可用于高代謝組織如心臟的工程化構(gòu)建。

二、研究目的

 

開發(fā)低溫培養(yǎng)策略：通過降低培養(yǎng)溫度（20-33.5°C）減少心肌細(xì)胞代謝率，解決三維高密度組織因營養(yǎng)供應(yīng)不足導(dǎo)致的壞死問題。

評估細(xì)胞存活與功能：分析低溫對心肌細(xì)胞存活、代謝活性及血管網(wǎng)絡(luò)形成的調(diào)控作用。

 

驗證移植效果：比較低溫和標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)的細(xì)胞片在活體移植后的存活率和功能恢復(fù)，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

 

背景基于三維組織工程中血管化難題，傳統(tǒng)37°C培養(yǎng)無法支持高代謝細(xì)胞（如心肌細(xì)胞）的長期存活，而低溫可能模擬體內(nèi)低代謝狀態(tài)，改善組織健康。

三、研究思路

研究采用細(xì)胞片工程結(jié)合多尺度分析：

 

細(xì)胞片制備：從新生大鼠心室分離心肌細(xì)胞，在溫度響應(yīng)培養(yǎng)皿上培養(yǎng)成單層細(xì)胞片，進(jìn)而堆疊成三層或五層三維組織。

溫度梯度實(shí)驗：在19.5°C、23°C、26.5°C、30°C、33.5°C和37°C下培養(yǎng)3-7天，分析代謝、存活和血管網(wǎng)絡(luò)。

多參數(shù)測量：包括細(xì)胞存活（活細(xì)胞計數(shù)、LDH泄漏）、代謝指標(biāo)（葡萄糖消耗、乳酸產(chǎn)生、氧氣濃度）、組織學(xué)（H&E染色、肌鈣蛋白T免疫染色）和血管網(wǎng)絡(luò)長度。

功能驗證：將五層細(xì)胞片移植至裸鼠皮下，評估移植后組織存活、血管化和電生理功能。

 

數(shù)據(jù)分析：使用成像軟件（如Image J）和流式細(xì)胞術(shù)量化結(jié)果，統(tǒng)計方法包括方差分析。

 

四、測量數(shù)據(jù)、來源及研究意義

研究測量了多維度數(shù)據(jù)，其意義及來源如下（數(shù)據(jù)均標(biāo)注自原文圖/表）：

 

細(xì)胞存活與代謝數(shù)據(jù)（數(shù)據(jù)來自Fig. 1）：

 

數(shù)據(jù)：單層細(xì)胞片在所有溫度下均存活，但三層和五層細(xì)胞片在33.5°C以上死亡細(xì)胞增加（Fig. 1F-G）；葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生隨溫度降低而減少（Fig. 1D-E），例如30°C時葡萄糖消耗比37°C低約40%。

 

研究意義：直接證實(shí)低溫降低細(xì)胞代謝，緩解高密度組織的營養(yǎng)壓力；為優(yōu)化培養(yǎng)溫度提供定量依據(jù)（最佳范圍為30-33.5°C）。

 

氧氣濃度數(shù)據(jù)（數(shù)據(jù)來自正文3.1節(jié)和補(bǔ)充圖S1，但主文檔無對應(yīng)圖片標(biāo)簽，故不嵌入）：

 

數(shù)據(jù)：使用Unisense氧微電極測量，30°C和37°C的氧濃度梯度分別為1.27±0.06和1.61±0.06 mg/L/mm，氧消耗率分別為0.16±0.001和0.27±0.001 pmol/h/cell。

 

研究意義：量化代謝抑制，低溫下氧消耗降低37%，表明細(xì)胞呼吸減弱，支持代謝調(diào)控假說。

 

組織學(xué)與細(xì)胞比例數(shù)據(jù)（數(shù)據(jù)來自Fig. 2）：

 

數(shù)據(jù)：H&E染色顯示，37°C培養(yǎng)的五層細(xì)胞片出現(xiàn)核丟失和層間間隙，而30°C時組織致密（Fig. 2A-F）；流式細(xì)胞術(shù)測心肌細(xì)胞比例，低溫培養(yǎng)（≤30°C）維持約40%，37°C降至15%（Fig. 2G）。

 

研究意義：揭示高溫導(dǎo)致心肌細(xì)胞特異性死亡，低溫保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，強(qiáng)調(diào)溫度對細(xì)胞類型的差異影響。

 

血管網(wǎng)絡(luò)形成數(shù)據(jù)（數(shù)據(jù)來自Fig. 3）：

 

 

數(shù)據(jù)：GFP標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞顯示，33.5°C時血管網(wǎng)絡(luò)長度最大（Fig. 3A-G）；37°C培養(yǎng)5天后網(wǎng)絡(luò)停滯，而33.5°C持續(xù)發(fā)展至7天（Fig. 3G）。

 

研究意義：中低溫（30-33.5°C）平衡細(xì)胞存活與血管生成，解決工程組織血管化難題；流式細(xì)胞術(shù)驗證內(nèi)皮細(xì)胞比例下降與網(wǎng)絡(luò)長度一致（Fig. 3H）。

 

移植效果數(shù)據(jù)（數(shù)據(jù)來自Fig. 4）：

 

數(shù)據(jù)：低溫處理（30°C）的五層細(xì)胞片移植后血管網(wǎng)絡(luò)更密集（Fig. 4B-C），組織存活率更高（Fig. 4F-H），肌鈣蛋白T陽性區(qū)域面積增大（11,530±4550 μm2 vs 標(biāo)準(zhǔn)處理8,302±2700 μm2）。

 

研究意義：證實(shí)低溫培養(yǎng)提升移植體存活和功能整合，為再生醫(yī)學(xué)提供實(shí)踐方案；電生理測量顯示移植體具有收縮功能。

 

五、研究結(jié)論

 

低溫提升存活率：培養(yǎng)溫度≤30°C時，三層和五層細(xì)胞片存活率顯著提高，心肌細(xì)胞比例維持40%以上，而37°C時大量死亡。

代謝抑制是關(guān)鍵：低溫降低葡萄糖消耗、乳酸產(chǎn)生和氧消耗，減少氧化應(yīng)激，改善細(xì)胞微環(huán)境。

血管網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化：30-33.5°C促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞形成可持續(xù)血管網(wǎng)絡(luò)，避免37°C下的停滯。

移植成功驗證：低溫處理細(xì)胞片在活體內(nèi)血管化良好、功能完整，支持其臨床轉(zhuǎn)化潛力。

 

應(yīng)用價值：為高代謝組織（如心臟、肝臟）工程提供低溫培養(yǎng)策略，克服傳統(tǒng)方法限制。

 

六、詳細(xì)解讀使用丹麥Unisense電極測量出來的數(shù)據(jù)有什么研究意義

丹麥Unisense電極（具體為Clark型氧微傳感器，型號OX-50）在本研究中用于原位測量細(xì)胞片培養(yǎng)介質(zhì)中的氧氣濃度梯度，其研究意義如下：

 

高分辨率代謝量化：

 

技術(shù)描述：Unisense氧微傳感器具有微米級尖端，可穿透培養(yǎng)介質(zhì)，以100μm間隔測量溶解氧濃度，提供實(shí)時空間梯度數(shù)據(jù)（如濃度變化率mg/L/mm）。

研究應(yīng)用：在單層細(xì)胞片上測量30°C和37°C的氧濃度分布，計算氧消耗率（正文3.1節(jié)，數(shù)據(jù)來自補(bǔ)充圖S1）。

 

研究意義：直接量化細(xì)胞呼吸強(qiáng)度——37°C時氧消耗率（0.27 pmol/h/cell）顯著高于30°C（0.16 pmol/h/cell），證實(shí)低溫抑制代謝活性，為“代謝降低假說”提供實(shí)證基礎(chǔ)。

 

揭示三維組織生存機(jī)制：

 

數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)：氧梯度數(shù)據(jù)與細(xì)胞存活結(jié)果（Fig. 1）耦合：高溫下氧消耗快，導(dǎo)致深層細(xì)胞缺氧壞死；低溫下氧需求減少，緩解擴(kuò)散限制。

 

研究意義：闡明三維組織存活瓶頸不僅是營養(yǎng)供應(yīng)，還包括氧動態(tài)平衡；Unisense數(shù)據(jù)幫助定位最佳溫度（30°C），使代謝與氧供應(yīng)匹配。

 

支持代謝指標(biāo)驗證：

 

校準(zhǔn)作用：氧消耗率與葡萄糖消耗、乳酸產(chǎn)生數(shù)據(jù)（Fig. 1D-E）一致，共同構(gòu)建代謝全景——低溫全面抑制糖酵解和氧化磷酸化。

 

研究意義：增強(qiáng)多參數(shù)測量的可靠性，避免單一指標(biāo)偏差；氧數(shù)據(jù)作為代謝“金標(biāo)準(zhǔn)”，驗證低溫培養(yǎng)的生理合理性。

 

技術(shù)優(yōu)勢與推廣價值：

 

原位與非侵入性：傳感器無需取樣，保持培養(yǎng)系統(tǒng)完整性，避免擾動細(xì)胞微環(huán)境。

 

研究意義：凸顯Unisense電極在組織工程中的實(shí)用性，尤其適用于三維系統(tǒng)的高通量篩查；方法可推廣至其他高代謝組織（如肝、腦）的氧動態(tài)研究。

 

綜上，Unisense電極數(shù)據(jù)是連接低溫培養(yǎng)與細(xì)胞存活的核心橋梁：通過精準(zhǔn)氧測量，不僅證實(shí)代謝抑制機(jī)制，還為優(yōu)化培養(yǎng)條件提供了關(guān)鍵參數(shù)，推動組織工程從經(jīng)驗性向定量化發(fā)展。這一技術(shù)的應(yīng)用有望加速臨床級組織構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程。