Inhibition of 1,4-dioxane on the denitrification process by altering the viability and metabolic activity of Paracoccus denitrificans

通過改變擬隱球菌的生活力和代謝活性，抑制1,4 -二惡烷對反硝化過程的影響

來源：Environmental Science and Pollution Research (2018) 25:27274–27282

 

論文總結

研究了新興污染物1,4-二氧六環對反硝化過程的影響，使用Paracoccus denitrificans作為模型反硝化細菌。以下從摘要、研究目的、研究思路、測量數據及意義、結論等方面進行總結，并詳細解讀使用丹麥Unisense電極測量數據的意義。

一、論文摘要

研究通過暴露P. denitrificans于不同濃度1,4-二氧六環（0.25%-1.0%, v/v），發現其顯著抑制反硝化效率，且呈劑量依賴性。對照組反硝化效率為98.5%，而0.50%、0.75%和1.0%劑量下分別降至78.5%、63.9%和9.3%。抑制機制包括：破壞細胞膜完整性（導致LDH泄漏）、降低細胞活力（CCK-8 assay）、抑制碳源（葡萄糖）利用和關鍵酶活性（糖酵解酶和反硝化還原酶）。1,4-二氧六環通過影響細胞增殖、代謝活動和酶功能，直接導致反硝化性能下降。研究強調1,4-二氧六環在環境中廣泛存在，可能破壞氮循環。

二、研究目的

 

評估1,4-二氧六環對反硝化的影響：作為新興污染物，1,4-二氧六環在化妝品、洗滌劑中常見，且環境濃度高（可達2000 mg/L），但其對微生物反硝化過程的影響未知。

揭示毒性機制：探究1,4-二氧六環如何通過影響細胞活力、膜完整性和代謝活動抑制反硝化。

 

提供環境風險洞察：為污染物調控氮循環提供科學依據，支持環境管理和政策制定。

 

背景基于反硝化在氮循環中的關鍵作用，以及污染物（如納米顆粒、抗生素）已知會干擾此過程，但1,4-二氧六環的具體效應尚未研究。

三、研究思路

研究采用實驗室批量實驗，設計如下：

 

細菌培養：使用P. denitrificans（ATCC 19367）在厭氧條件下培養，洗滌后重懸于PBS緩沖液。

暴露實驗：在血清瓶中加入基礎培養基（含葡萄糖和NO?-N），添加不同濃度1,4-二氧六環（0.25%-1.0%），以無添加為對照。厭氧培養24小時，定期采樣。

多參數測量：監測反硝化效率（NO?-N、NO?-N、N?O濃度）、細胞生長（OD600）、細胞活力（CCK-8）、膜完整性（LDH釋放）、葡萄糖利用、關鍵酶活性（糖酵解酶HK、PFK、GAPDH；反硝化酶NAR、NIR、NOR、N?OR）。

 

數據分析：使用ANOVA進行統計檢驗，P<0.05視為顯著。

 

四、測量數據、來源及研究意義

研究測量了多維度數據，其意義及來源如下（數據均標注自原文圖/表）：

 

反硝化效率（數據來自Fig. 1）：

 

數據：NO?-N去除率隨1,4-二氧六環濃度增加而降低（1.0%劑量下僅9.3%）；NO?-N和N?O積累增加（如1.0%劑量下NO?-N達4.7 mg/L，N?O持續上升）。

 

研究意義：直接證明1,4-二氧六環抑制反硝化過程，導致氮中間產物積累，可能增加N?O排放（溫室氣體）。

 

細胞生長和活力（數據來自Fig. 2和Fig. 3）：

 

 

數據：OD600值在1.0%劑量下僅為0.15（對照為1.66）；細胞活力在1.0%劑量下降至36%（對照100%）。

 

研究意義：表明1,4-二氧六環抑制細菌增殖和存活，減少反硝化功能微生物數量。

 

膜完整性（數據來自Fig. 4）：

 

數據：LDH釋放量在1.0%劑量下為對照的185%。

 

研究意義：1,4-二氧六環破壞細胞膜，導致內容物泄漏，影響細胞穩態和功能。

 

葡萄糖利用（數據來自Fig. 5b）：

 

數據：葡萄糖消耗量在1.0%劑量下僅為275 mg（對照1828 mg）。

 

研究意義：抑制碳源代謝，減少能量供應，間接影響反硝化。

 

糖酵解酶活性（數據來自Fig. 5c）：

 

數據：HK、PFK和GAPDH活性在1.0%劑量下分別降至對照的32%、~40%和40%。

 

研究意義：1,4-二氧六環直接抑制糖酵解關鍵酶，阻礙ATP和NADH生成，影響反硝化能量需求。

 

反硝化酶活性（數據來自Fig. 6b）：

 

數據：NAR、NIR、NOR和N?OR活性在1.0%劑量下分別降至對照的45%、~50%、~50%和~50%。

 

研究意義：直接酶抑制是反硝化效率下降的主因；N?OR抑制導致N?O積累，加劇環境風險。

 

所有數據均通過三重重復驗證，統計顯著（P<0.05），補充表（Table S1-S5）提供詳細統計結果。

五、研究結論

 

劑量依賴性抑制：1,4-二氧六環高劑量（≥0.50%）顯著抑制反硝化效率，導致氮去除率下降和中間產物積累。

毒性機制：通過破壞細胞膜完整性、降低細胞活力和抑制代謝酶活性（糖酵解和反硝化酶）實現抑制。

環境啟示：1,4-二氧六環在環境中的廣泛存在可能威脅氮循環平衡，需加強監測和治理。

 

方法學貢獻：整合多參數（生長、活力、酶活）全面評估污染物毒性，為類似研究提供范式。

 

六、詳細解讀使用丹麥Unisense電極測量出來的數據有什么研究意義

丹麥Unisense電極（具體為Clark型氧微傳感器或類似氣體微傳感器）在本研究中用于測量 nitric oxide (NO) 和 nitrous oxide (N?O) 濃度，以評估反硝化酶活性（NOR和N?OR）。其研究意義如下：

 

高精度實時監測：

 

技術描述：Unisense微傳感器具有高空間和時間分辨率（每秒測量），可原位監測氣體濃度變化，避免樣品破壞或離線分析誤差。

研究應用：在酶活性測定中（方法部分），用于實時記錄NO和N?O消耗率（如NOR活性測NO消耗，N?OR活性測N?O消耗），計算酶活性單位（μmol/min/mg protein）。

 

研究意義：提供直接、動態的酶活性數據，比傳統終點法更準確；實時跟蹤允許捕獲瞬時變化，提高數據可靠性。

 

關鍵酶活性量化：

 

數據關聯：Unisense數據用于計算NOR和N?OR活性（Fig. 6b），顯示1,4-二氧六環劑量依賴性抑制（如1.0%劑量下活性降至~50%）。

 

研究意義：直接鏈接酶活性抑制與反硝化效率下降（如N?O積累），闡明毒性機制；N?OR抑制尤其重要，因它導致N?O排放（強溫室氣體），凸顯環境風險。

 

方法優勢與創新：

 

非侵入性和高通量：微傳感器小巧，適用于微量反應體系（1.7 mL混合物），減少樣品量需求；同時監測多個樣品，提高效率。

 

研究意義：克服傳統色譜法的時間延遲和樣品處理問題；支持高通量篩查污染物毒性，適用于其他酶學研究。

 

環境應用擴展：

 

潛在用途：Unisense技術可應用于實際環境監測（如沉積物、廢水），實時評估反硝化活性和污染物影響。

 

研究意義：為現場研究提供工具，幫助預測污染物對氮循環的實時影響，支持風險管理。

 

總之，Unisense電極數據是揭示酶水平抑制的關鍵，通過提供精確、實時氣體測量，它直接驗證了1,4-二氧六環對反硝化酶的毒性，增強了研究的機制深度和說服力。這突出了先進傳感技術在環境微生物學中的價值，推動從宏觀效應向微觀機制的理解轉型。