光催化產(chǎn)生H2的測(cè)量結(jié)果

使用外部光源(350W Xe燈)測(cè)量光催化產(chǎn)生的H2。在厭氧室的厭氧條件下，在100毫升血清瓶中準(zhǔn)備了20毫升含有1毫摩爾(NH4)2Fe(SO4)2、1毫摩爾NiCl2、100毫摩爾抗壞血酸和5毫摩爾MV2+的LB培養(yǎng)基和工程大腸桿菌細(xì)胞。系統(tǒng)被抽空，以去除手套箱大氣中的N2和H2。在反應(yīng)開始后加入IPTG，先后誘導(dǎo)CdS納米粒子的原位合成和氫化酶的過(guò)表達(dá)。用微型注射器直接將樣品注入氣體采樣器，然后用氣相色譜儀分析產(chǎn)生的H2量。然后將樣品注入配備熱導(dǎo)檢測(cè)器的氣相色譜儀(Kejie GC5890C，配有硅膠柱和熱導(dǎo)檢測(cè)器傳感器)，以同時(shí)測(cè)定H2、O2和N2的濃度。為了在有氧條件下進(jìn)行測(cè)量，對(duì)厭氧條件下制備的反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行了仿生物硅膠封裝。

仿生硅膠封裝

通過(guò)離心收集含有CdS納米粒子的工程大腸桿菌細(xì)胞，然后對(duì)其進(jìn)行Choi等人描述的仿生二氧化硅封裝方案。工程細(xì)胞在PDADMAC溶液和PSS溶液中交替浸泡，每步5分鐘。LbL過(guò)程結(jié)束后，將多層包裹的細(xì)胞放入50mM硅酸溶液中。最后通過(guò)離心收獲封裝的生物雜交聚集體，并均勻分散成2000微米的顆粒。

微電極測(cè)量

O2微電極是一種尖端直徑為25μm的OX25微電極(Unisense)。通過(guò)用O2微電極刺穿聚集的大腸桿菌來(lái)檢測(cè)其體內(nèi)的O2濃度。新鮮制備的聚合大腸桿菌細(xì)胞用于在有氧條件下至少12小時(shí)的產(chǎn)氫測(cè)量。然后，從反應(yīng)系統(tǒng)中收獲聚集體。將單層聚集體固定在瓊脂基底(瓊脂重量百分比為1%)上，當(dāng)微電極尖端刺入聚集體時(shí)，微機(jī)械手的步長(zhǎng)為1μm。

結(jié)果

CdS納米粒子的生物合成

我們首先探索了大腸桿菌細(xì)胞對(duì)CdS納米粒子的生物合成。CdS是一種經(jīng)過(guò)深入研究的半導(dǎo)體，其光催化活性已在生物無(wú)機(jī)雜化系統(tǒng)中得到充分驗(yàn)證。然而，這種半導(dǎo)體的合成需要復(fù)雜的工藝和昂貴的試劑。添加的外源金屬材料的生物相容性也會(huì)影響生物反應(yīng)器的效率。Yang等人利用非光合細(xì)菌Moorella thermoacetica開創(chuàng)了從二氧化碳中光合作用合成醋酸的混合策略，取得了關(guān)鍵性進(jìn)展，該細(xì)菌展示了生物沉淀CdS納米粒子的獨(dú)特代謝途徑。受Yang及其同事研究的啟發(fā)，我們意識(shí)到，我們先前設(shè)計(jì)的大腸桿菌細(xì)胞表面顯示了一種鉛特異性結(jié)合蛋白PbrR，可能會(huì)發(fā)揮與Moorella thermoacetica類似的功能。PbrR蛋白含有三個(gè)保守的半胱氨酸殘基，它們通過(guò)獨(dú)特的半定向幾何結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)鉛(II)金屬中心。PbrR蛋白在大腸桿菌細(xì)胞表面的顯示允許選擇性吸附鉛和鎘離子，并在細(xì)胞外膜上形成PbS和CdS納米顆粒。此外，作為基因工程中最重要的微生物，大腸桿菌在基因組和代謝機(jī)制方面已得到了深入研究，并已成為合成生物學(xué)中最重要的細(xì)胞模式。因此，將光合生物雜交系統(tǒng)應(yīng)用于大腸桿菌細(xì)胞是非常可取的，從而擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍。

圖2大腸桿菌細(xì)胞-CdS混合系統(tǒng)的氫光合作用。(A)工程大腸桿菌細(xì)胞詳圖。(B)工程大腸桿菌細(xì)胞表面生物合成的CdS納米粒子的TEM圖像。(C)隨機(jī)選擇的CdS納米粒子的EDX確認(rèn)。(D)混合系統(tǒng)在厭氧條件下產(chǎn)生的H2。(E)混合系統(tǒng)在輻照過(guò)程中產(chǎn)生H2的速率變化。

隨后，我們研究了表面顯示PbrR的大腸桿菌細(xì)胞，以用于CdS納米粒子的生物沉淀。我們將先前研究中構(gòu)建的包括大腸桿菌外膜蛋白A(OmpA)和PbrR蛋白的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21中(圖2A)。

用阿拉伯糖誘導(dǎo)表面顯示的PbrR蛋白的表達(dá)，并在培養(yǎng)基中加入Cd2+引發(fā)CdS納米顆粒的生物沉淀。我們使用透射電子顯微鏡和能量色散X射線光譜(TEMEDX)觀察了CdS納米粒子的沉淀過(guò)程。如透射電子顯微鏡圖像所示，鎘離子在細(xì)胞表面積聚并形成了大小小于50nm的均勻納米粒子團(tuán)(圖2B)，這在Yang等人對(duì)M.thermoacetica-CdS雜交體系的研究中也觀察到了。此外，對(duì)隨機(jī)選擇的包含部分CdS納米顆粒的區(qū)域進(jìn)行的EDX分析也證實(shí)了其元素組成(圖2C)。使用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)測(cè)量了PbrR表達(dá)的大腸桿菌細(xì)胞表面生物合成的CdS納米顆粒的數(shù)量，24小時(shí)后達(dá)到8.09±0.70μg/108 cells，該數(shù)值遠(yuǎn)高于未顯示PbrR的細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了表面顯示的PbrR介導(dǎo)的CdS納米粒子在細(xì)胞外膜上的生物沉淀。

大腸桿菌細(xì)胞-CdS混合系統(tǒng)的氫光合作用

我們進(jìn)行了紫外-可見(jiàn)(UV-vis)光譜測(cè)量，以直接確定這些CdS納米粒子的光帶隙能以及CdS納米粒子在細(xì)菌細(xì)胞外膜上生物沉淀的光催化能力。在太陽(yáng)光譜的可見(jiàn)光區(qū)域檢測(cè)到了生物合成的CdS納米粒子的最低能量轉(zhuǎn)變(Eg=2.92eV，λabsorption=424nm)，證實(shí)了原位生物合成的CdS納米粒子的光催化能力。反應(yīng)溶液中還含有抗壞血酸和甲基維生物素(MV2+)。抗壞血酸通常用作再生CdS納米粒子的犧牲電子供體。氧化還原染料MV2+是一種成熟的電子介質(zhì)。結(jié)合MV2+，半導(dǎo)體/細(xì)菌細(xì)胞混合系統(tǒng)很容易成為H2光合作用的生物催化劑。在厭氧條件下測(cè)量了各實(shí)驗(yàn)組中還原MV的濃度，證實(shí)了沉淀在工程大腸桿菌細(xì)胞上的CdS納米粒子能吸附光子并將電子傳遞給MV2+。利用氣相色譜法(GC)檢測(cè)了該混合系統(tǒng)在厭氧條件下產(chǎn)生的H2量。在無(wú)光條件下，由于內(nèi)源表達(dá)的氫化酶介導(dǎo)的厭氧發(fā)酵，在有或沒(méi)有CdS的情況下，工程大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生了微量的H2。然而，在350瓦Xe燈的照射下，攜帶CdS納米粒子的工程大腸桿菌細(xì)胞(1×108個(gè))在6小時(shí)后形成近13.40±1.20μmol H2，24小時(shí)后達(dá)到81.80±7.39μmol，這一數(shù)值明顯高于其他處理的數(shù)值(圖2D)。此外，該雜交系統(tǒng)的H2光合作用速率在最初的18小時(shí)內(nèi)從每小時(shí)0.56μmol/108個(gè)細(xì)胞穩(wěn)步上升到1.15μmol/108個(gè)細(xì)胞，隨后由于細(xì)菌死亡而開始下降(圖2E)。根據(jù)這些結(jié)果，我們的工程大腸桿菌細(xì)胞-CdS雜交系統(tǒng)在厭氧條件下產(chǎn)生的H2與生物合成的CdS半導(dǎo)體和全細(xì)胞生物催化劑的活性直接相關(guān)。