動(dòng)物模型和體內(nèi)血管生成試驗(yàn)：

股動(dòng)脈結(jié)扎（FAL）和體內(nèi)血管生成試驗(yàn)按照之前的研究進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉小鼠，并切除它們的后肢。體溫保持在37.0±0.5°C。通過(guò)一個(gè)2毫米的切口暴露左股動(dòng)脈，切口不牽拉，盡量減少對(duì)組織的干擾。在股外側(cè)尾動(dòng)脈和上淺動(dòng)脈起源的遠(yuǎn)端以及股動(dòng)脈的近端（腹股溝韌帶下方）放置一個(gè)7-0結(jié)扎。在縫線之間橫斷股動(dòng)脈并分離1-2毫米，用生理鹽水清洗傷口并密封。最后，注射丁丙諾啡（0.05-0.1毫克/千克）。

為了評(píng)估培養(yǎng)的EPCs的血管生成能力，將不同組（包括GPR4上調(diào)組和GPR4基線組）的EPCs（5×105個(gè)細(xì)胞）重懸于100-200μl的預(yù)熱PBS（37°C）中，然后移植到結(jié)扎動(dòng)脈附近的5個(gè)部位。安慰劑小鼠也注射相同體積的PBS。使用激光多普勒成像儀檢測(cè)后肢皮下血流。分別在注射后0、3、7、14和21天測(cè)量缺血和非缺血后肢的血流量。21天后，小鼠被處死。肢體缺損評(píng)分按以下等級(jí)計(jì)算：0=無(wú)，1=趾尖壞死，2=趾部壞死，3=足部壞死，4=腿部壞死，5=整條腿缺失。

免疫組化和免疫熒光分析：

免疫組化染色如前所述。簡(jiǎn)言之，進(jìn)行右股動(dòng)脈結(jié)扎和股淺動(dòng)脈（SFA）切除。在0.01M檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）中通過(guò)微波爐加熱進(jìn)行復(fù)水和抗原回收。按照制造商的說(shuō)明，用兔單克隆PECAM-1抗體孵育切片，然后用HRP抗兔DAB檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。使用光學(xué)顯微鏡獲取免疫組織學(xué)圖像。血管密度通過(guò)計(jì)數(shù)CD31切片免疫組化染色中的血管數(shù)量確定，并以每平方毫米血管數(shù)表示。

為了進(jìn)行免疫熒光分析，所有切片都用一抗在4°C孵育過(guò)夜，然后用GFP結(jié)合物山羊抗兔二抗染色。為了評(píng)估不同組的細(xì)胞增殖情況，手術(shù)后2周內(nèi)每天兩次皮下注射，組織切片也用Cy5結(jié)合的抗BrdU抗體（Sigma）染色，以評(píng)估毛細(xì)血管密度。細(xì)胞核用DAPI反染。使用共聚焦顯微鏡獲取免疫熒光圖像。

Real-timePCR檢測(cè)：

用高純度RNA分離試劑盒提取總RNA。使用PrimeScript®RT試劑盒合成第一鏈cDNA。使用StepOnePlus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)，采用2-ΔΔCT分析方法對(duì)該家族的mRNA表達(dá)進(jìn)行量化，一式三份。GPR4的PCR引物如下：正向5′-AACCTCTATCGGGTGTTCGTG-3′，反向5′-TTGGCTGTGCTGTTCCTCTTGG-3′。擴(kuò)增GAPDH作為內(nèi)標(biāo)。用2(-DeltaDeltaC(T))法測(cè)定每個(gè)樣本中的相對(duì)RNA水平。

液滴數(shù)字PCR檢測(cè)：

液滴數(shù)字PCR（ddPCR）和基于EvaGreenChemistry的數(shù)據(jù)分析按照生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行。Supermix(2X)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad。PCR中引物的最終濃度為200nM，最終反應(yīng)體積為20μL。每個(gè)反應(yīng)有1μLcDNA，NTC時(shí)加入1μL無(wú)核酸水代替cDNA。使用BioRad自動(dòng)液滴發(fā)生器生成液滴。PCR條件如下95℃5分鐘，50℃30秒，56.5℃30秒，72℃45秒。最后在72℃延伸5分鐘，然后在4℃5分鐘和90℃5分鐘進(jìn)行信號(hào)穩(wěn)定步驟。PCR結(jié)束后，使用QX200液滴閱讀器分析液滴，并使用Bio-RadQuantaSoft軟件分析數(shù)據(jù)。

Western印跡分析：

細(xì)胞在添加了1-mMPMSF的RIPA緩沖液中裂解。蛋白提取物經(jīng)SDS-PAGE處理后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。使用以下抗體：兔抗GPR4抗體、抗VEGFA抗體和兔抗GAPDH抗體。蛋白用HRP結(jié)合的抗兔IgG顯色，然后使用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯色。

統(tǒng)計(jì)分析：

所有結(jié)果均表示為標(biāo)準(zhǔn)差±均值，通過(guò)學(xué)生t檢驗(yàn)或方差分析評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS版本21.0）進(jìn)行。

結(jié)果：

1.表型特征

圖1：培養(yǎng)28天后EPC的表型特征。a通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)確定EPC的細(xì)胞表面標(biāo)記。B EPC對(duì)DiI-acLDL攝取和FITC標(biāo)記的UEA-1結(jié)合均呈陽(yáng)性。細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）染色。c循環(huán)EPCs在培養(yǎng)后不同時(shí)間點(diǎn)（第0天、第7天和第28天）的形態(tài)變化序列。

共有20人參加了研究，其中CAD組和健康組各有10人。兩組基線特征無(wú)明顯差異。晚期EPC由培養(yǎng)28天的PBMNCs獲得（圖1c），與之前的研究類(lèi)似。培養(yǎng)28天后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析培養(yǎng)的EPCs的標(biāo)記蛋白，包括KDR、CD31和CD144（圖1a），EPCs的DiI-acLDL攝取和FITC標(biāo)記的凝集素-1結(jié)合均為陽(yáng)性（圖1b）。

2.不同的EPC在酸性環(huán)境中具有不同的血管生成能力

圖2：不同pH環(huán)境對(duì)來(lái)自非CAD和CAD患者的EPC血管生成的影響。a,b不同pH環(huán)境培養(yǎng)6h后，EPC管形成（a比例尺=40μm）和遷移（b比例尺=20μm）的代表性照片和定量分析。c來(lái)自非CAD或CAD后肢缺血的EPC介導(dǎo)的新生血管的代表性照片和定量分析。D HE、IHC-CD31、IF-CD31和BrdU染色的后肢缺血切片，以及CD31陽(yáng)性血管、CD31陽(yáng)性微血管和BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的定量分析。

為了確定不同患者EPC的體外血管生成能力，采用了Matrigel實(shí)驗(yàn)。與在pH值為7.4的環(huán)境中相比，非CAD組的EPCs在酸刺激下的血管生成明顯增強(qiáng)，而CAD組的EPCs在相同處理下的結(jié)果則相反（圖2a）。傷口愈合的結(jié)果也類(lèi)似（圖2b）。為了進(jìn)一步探討這些結(jié)果的穩(wěn)健性，我們將非CAD組和CAD組的EPCs全身注射到后肢缺血的裸鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示，與注射CAD組EPCs的裸鼠相比，注射非CAD組EPCs的裸鼠血流恢復(fù)更快（圖2c）。后肢的免疫組化結(jié)果見(jiàn)圖2d。

3.EPC上質(zhì)子傳感G蛋白偶聯(lián)受體的表達(dá)

圖3：非CAD和CAD患者EPCs中質(zhì)子傳感GPCR家族的表達(dá)和血管生成能力。a使用dPCR測(cè)定EPCs中質(zhì)子感應(yīng)GPCR家族表達(dá)的mRNA水平。b,c GPCR家族蛋白質(zhì)水平的代表性照片和定量分析。d dPCR用于測(cè)定不同pH環(huán)境中GPR4的mRNA水平。e不同pH值環(huán)境下GPR4表達(dá)的定量分析和代表性照片，然后用GPR4抗體進(jìn)行免疫印跡。f,g用siRNA-NC或siRNA-GPR4轉(zhuǎn)染EPCs，拍攝Matrigel管樣形成試驗(yàn)（比例尺=40μm）和劃痕試驗(yàn)（比例尺=20μm）的代表性照片并進(jìn)行定量分析。

與使用ddPCR對(duì)其他類(lèi)型細(xì)胞進(jìn)行的研究類(lèi)似，我們的結(jié)果顯示，四種類(lèi)型的質(zhì)子傳感G蛋白偶聯(lián)受體亞型均在EPCs上表達(dá)，其中GPR4的表達(dá)量最高，這一點(diǎn)在Western印跡中得到了進(jìn)一步證實(shí)（圖3a-c）。此外，ddPCR和Western印跡結(jié)果顯示，在酸性環(huán)境中，CAD患者的GRP4表達(dá)量明顯低于非CAD患者，而無(wú)論pH值如何，組間差異均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3d，e）。在使用siRNA-GRP4下調(diào)GRP4表達(dá)的CAD患者的EPCs中，我們發(fā)現(xiàn)EPCs的體外血管生成能力在酸性環(huán)境中受損，而在pH7.4環(huán)境中沒(méi)有受損（圖3f），傷口愈合試驗(yàn)也得出了類(lèi)似的結(jié)果（圖3g）。

4.GPR4基因轉(zhuǎn)移增強(qiáng)了酸性微環(huán)境中EPC的血管生成能力

圖4：GPR4基因轉(zhuǎn)移可恢復(fù)CAD患者EPCs酸性介導(dǎo)的血管生成。a,b EPCs在不同pH環(huán)境中培養(yǎng)6h后，管形成（a比例尺=40μm）和遷移（b比例尺=20μm）的代表性照片和定量分析。c注射EPCs后裸鼠后肢缺血血流的代表性照片和定量分析。d缺血后肢的HE、IHC-CD31和IF-CD31染色切片。

將人類(lèi)GPR4cDNA克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒中。Western印跡證實(shí)了GPR4在EPCs中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。與載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的EPCs相比，pcDNA3.1(+)-GPR4轉(zhuǎn)導(dǎo)的EPCs在酸性微環(huán)境中的血管生成明顯增強(qiáng)，而在pH值為7.4的環(huán)境中，組間差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4a，b）。

為了確定GPR4基因轉(zhuǎn)移對(duì)EPC介導(dǎo)的體內(nèi)血管生成的影響，將pcDNA3.1(+)-GPR4轉(zhuǎn)導(dǎo)的EPCs和載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的EPCs全身注射到后肢缺血的裸鼠體內(nèi)。值得注意的是，與載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的EPCs相比，pcDNA3.1(+)-GPR4轉(zhuǎn)導(dǎo)的EPCs能明顯增加裸鼠后肢皮下血流量（圖4c）。后肢的免疫組化和免疫熒光見(jiàn)4d。