3.結(jié)果

3.1.支架的形態(tài)和機(jī)械性能

我們先前建立了一個(gè)將GYY摻入SF基支架的制造工藝。圖1顯示通過(guò)FE-SEM收集的支架形態(tài)代表性圖像（圖1A）和通過(guò)共聚焦顯微鏡的3D支架重建（圖1B）的SF_GYY 5%支架。SF、SF_GYY 1.25%和SF_GYY 5%支架顯示相似的形態(tài)特征（數(shù)據(jù)未顯示）：高度多孔的海綿狀結(jié)構(gòu)，具有圓形孔均勻分布和廣泛互連。孔尺寸在80μm和350μm之間。機(jī)械壓縮測(cè)試顯示所有支架具有相似的應(yīng)力-應(yīng)變曲線profile（圖1C）和相似的楊氏模量值（圖1D）：SF為135.5±7.5kPa；SF_GYY 1.25%為128.0±13.3 kPa；SF_GYY 5%為122.2±5.9kPa。差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明GYY加載過(guò)程不影響SF基質(zhì)的原始彈性properties。

3.2.hMSCs在SF_GYY支架中培養(yǎng)保持活力和增殖能力

為了確認(rèn)H?S釋放支架（SF_GYY）可以從H?S特性中受益并改善hMSCs的成骨分化，我們首先評(píng)估了12小時(shí)內(nèi)的H?S釋放，而不是先前的2.5小時(shí)評(píng)估。如圖2A所示，當(dāng)SF_GYY支架置于水溶液中時(shí)，H?S在至少12小時(shí)的時(shí)間跨度內(nèi)釋放。我們證明了H?S釋放的動(dòng)力學(xué)取決于加載的GYY量。特別是，SF_GYY 1.25%在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間產(chǎn)生約3.5μM的穩(wěn)定H?S釋放。相反，SF_GYY 5%在前3小時(shí)釋放增加的H?S濃度，峰值約為10μM；隨后，H?S水平緩慢下降，達(dá)到與SF_GYY 1.25%相似的濃度。

為了排除短期細(xì)胞毒性，我們?cè)谟胔MSCs接種支架后24小時(shí)進(jìn)行LDH測(cè)定。如圖2B所示，與對(duì)照SF相比，SF_GYY 1.25%或SF_GYY 5%均未顯示任何顯著的LDH釋放增加。通過(guò)用去污劑處理細(xì)胞產(chǎn)生的陽(yáng)性對(duì)照誘導(dǎo)了LDH的實(shí)質(zhì)性增加。

最后，我們分析了H?S對(duì)在生物反應(yīng)器內(nèi)支架中在成骨刺激下培養(yǎng)的hMSCs的影響。如H&E染色所示，支架隨時(shí)間被hMSCs越來(lái)越多地定殖（補(bǔ)充圖2）。Calcein/EthD-1（圖2Ca-c;D7）和Ki67染色（圖2Cd-f;D21）證實(shí)hMSCs是存活和增殖的。此外，與圖2A所示的SF_GYY 5%更高的H?S釋放一致，我們發(fā)現(xiàn)在D7和D21，SF_GYY 5%始終顯示出比SF_GYY 1.25%更高的礦化（數(shù)據(jù)未顯示）。基于此證據(jù)，我們隨后的實(shí)驗(yàn)集中在SF_GYY 5%與對(duì)照SF上。

3.3.SF_GYY 5%增加成骨相關(guān)、整合素和血管生成基因的mRNA表達(dá)

為了識(shí)別H?S誘導(dǎo)的潛在靶基因，我們研究了一組參與骨化、成骨細(xì)胞分化、骨礦物代謝的基因的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)的摘要報(bào)告在補(bǔ)充表1和2中，其中數(shù)據(jù)分別表示為與D0相比的倍數(shù)變化，以及所有時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照SF支架相比的倍數(shù)變化。圖3代表了這些基因中選擇的mRNA表達(dá)。這些數(shù)據(jù)顯示，在SF_GYY 5%與對(duì)照SF中，mRNA在成骨過(guò)程中受到不同的調(diào)節(jié)。雖然在對(duì)照SF中，ALP、BGLAP、RUNX2、DLX-5、BMP4、BMPR1A、BMPR2和COLLXV的表達(dá)僅在D21實(shí)質(zhì)性增加，但在SF_GYY 5%中，它們?cè)谂囵B(yǎng)早期D7就顯示出顯著上調(diào)的趨勢(shì)，并在D21進(jìn)一步增加。特別是，與基線表達(dá)相比，在SF_GYY 5%中培養(yǎng)的hMSCs在D21時(shí)ALP和BGLAP顯著上調(diào)（p<0.0001）。值得注意的是，BMPR2受體和DLX-5（一種BMP信號(hào)分子）在D21時(shí)在SF_GYY 5%中與對(duì)照SF相比顯著上調(diào)。此外，它們?cè)贒0時(shí)甚至已經(jīng)顯著上調(diào)（p<0.05），從而表明H?S也可能獨(dú)立于成骨刺激啟動(dòng)成骨分化。

補(bǔ)充表1提供了成骨相關(guān)基因的更廣泛概述。與基線相比，在D7時(shí)，SF_GYY 5%中24%的基因上調(diào)超過(guò)2倍，而對(duì)照SF為8%。在D21時(shí)，與基線相比，SF_GYY 5%（65%）和對(duì)照SF（62%）中高百分比的基因上調(diào)。雖然這些上調(diào)大多數(shù)未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，可能由于原代hMSCs的供體間變異性，我們發(fā)現(xiàn)了一些顯著上調(diào)。軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP）在D7時(shí)在SF_GYY 5%和對(duì)照SF中均顯著上調(diào)（p<0.05）；SMAD家族成員5（SMAD5）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體2（TGFBR2）在D21時(shí)在對(duì)照SF中顯著上調(diào)（p<0.05）。補(bǔ)充表2比較了每個(gè)時(shí)間點(diǎn)SF_GYY 5%與對(duì)照SF的基因表達(dá)，并指出mRNA表達(dá)的增加在D7達(dá)到峰值。

此外，我們的數(shù)據(jù)顯示，在SF_GYY 5%中，整合素的表達(dá)高于對(duì)照SF（補(bǔ)充表2）。特別是，如圖4所示，我們發(fā)現(xiàn)雖然ITGA2在成骨過(guò)程中在對(duì)照SF中下調(diào)（p<0.0001），但在SF_GYY 5%中未下調(diào)，導(dǎo)致在D21時(shí)SF_GYY 5%中的ITGA2量高于對(duì)照SF（p<0.0001）。此外，ITAG1在D7和D21時(shí)在SF_GYY 5%中顯示出顯著上調(diào)的趨勢(shì)。

最后，如圖4所示，主血管生成因子VEGF A及其受體FLT-1的表達(dá)量隨時(shí)間穩(wěn)步增加，并且在SF_GYY 5%中比對(duì)照SF更高。雖然FLT-1的上調(diào)未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但與基線相比，SF_GYY 5%中VEGF A在D21時(shí)顯著增加（p<0.0001），并與對(duì)照SF相比也顯著增加（p<0.0001）。

3.4.SF_GYY 5%促進(jìn)提前和增強(qiáng)的礦化

為了研究支架內(nèi)hMSCs的成骨表型，我們通過(guò)染色鈣和磷酸鹽/碳酸鹽（羥基磷灰石的兩個(gè)主要組成部分）來(lái)分析礦物沉積。

圖5A顯示了支架縱切面在D7時(shí)AR-S(a,b)和VK(c,d)染色的代表性圖片。這些數(shù)據(jù)表明，與對(duì)照SF(圖5Aa-c)相比，SF_GYY 5%支架(圖5Ab-d)中的礦物沉積更早且更明顯。到D21的后期時(shí)間點(diǎn)，對(duì)照SF中的礦物沉積也增加了(圖5Be-g)，同時(shí)證實(shí)SF_GYY 5%中的礦物含量更高(圖5Bf-h)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了我們先前關(guān)于hMSCs二維成骨培養(yǎng)的數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)表明GYY在培養(yǎng)早期D7即可誘導(dǎo)礦化(補(bǔ)充圖3)。

圖6顯示了在更高放大倍數(shù)下D0和D21的代表性圖片。雖然在D0時(shí)已經(jīng)觀察到AR+細(xì)胞(圖6Aa-b)，但磷酸鹽/碳酸鹽在培養(yǎng)后期才出現(xiàn)，因?yàn)閷?duì)照SF和SF_GYY 5%在D0時(shí)均未顯示VK+染色(圖6Ac,d)。hMSCs早期產(chǎn)生鈣，與H?S的存在和成骨刺激無(wú)關(guān)，這可能歸因于播種階段的高流速（播種時(shí)3 ml/min，培養(yǎng)時(shí)0.3 ml/min），因?yàn)橐呀?jīng)強(qiáng)調(diào)hMSCs的成骨行為依賴于所應(yīng)用的灌注速率。

在后期時(shí)間點(diǎn)，礦物沉積與構(gòu)建體內(nèi)的hMSCs(圖6Be,f,g,h)和SF基質(zhì)(圖6Ci,j,k,l)共定位。此外，在SF_GYY 5%中以及SF基質(zhì)更致密的部位（在支架縱切面的每個(gè)圖片底部可見(jiàn)；圖5），AR-S+和VK+染色更為明顯。

最后，在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)下灌注支架的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了一群非粘附的hMSCs。當(dāng)收集培養(yǎng)基并放入培養(yǎng)瓶時(shí)，細(xì)胞在72小時(shí)內(nèi)形成類似于CFU-F集落的聚集體(補(bǔ)充圖4a-c)。只有從H?S釋放支架獲得的細(xì)胞形成了AR-S+集落(補(bǔ)充圖4e-f)。

總體而言，這些數(shù)據(jù)表明，支架釋放的H?S不僅能夠增加礦物沉積的量，而且與在對(duì)照SF中培養(yǎng)的hMSCs相比，還能提前礦物沉積。

3.5.SF_GYY 5%增加成骨和血管生成標(biāo)志物的蛋白表達(dá)

為了進(jìn)一步確定GYY誘導(dǎo)向成骨分化進(jìn)展的能力，我們使用免疫組化分析ALP和CSE的表達(dá)，CSE是負(fù)責(zé)H?S生成的關(guān)鍵酶之一，我們最近描述其與hMSCs的成骨分化相關(guān)。圖7顯示了培養(yǎng)D21時(shí)細(xì)胞(圖7Aa,b)和SF基質(zhì)內(nèi)(圖7Ac,d)ALP染色的高放大倍數(shù)代表性圖片。與對(duì)照SF(圖7Aa,c)相比，SF_GYY 5%(圖7Ab,d)顯示ALP表達(dá)增加。特別是，我們觀察到與對(duì)照SF相比，SF_GYY 5%的細(xì)胞內(nèi)部(圖7Aa-b)和SF基質(zhì)內(nèi)部(圖7Ac-d)的ALP+表達(dá)大幅上調(diào)。

在對(duì)照SF的hMSCs(圖7B e)和SF基質(zhì)孔隙內(nèi)(圖7Bg)檢測(cè)到D21時(shí)有適度的CSE表達(dá)；相反，SF_GYY 5%在同一時(shí)間點(diǎn)顯示CSE表達(dá)顯著增加(圖7Bf,h)。此外，H?S刺激也在細(xì)胞播種后僅24小時(shí)導(dǎo)致構(gòu)建體內(nèi)CSE表達(dá)增加（數(shù)據(jù)未顯示），表明存在獨(dú)立于成骨刺激的正反饋環(huán)。

最后，我們?cè)u(píng)估了VEGF A的蛋白表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)從D0的早期時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始，SF_GYY 5%中的VEGFA蛋白表達(dá)就高于對(duì)照SF(圖8a,b)。表達(dá)增加在D7達(dá)到峰值，此時(shí)VEGF A主要在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并且在表層(圖8c,d)和支架內(nèi)部(圖8e,f)均高度表達(dá)。

3.6.SF_GYY 5%提前形成礦化-血管生成結(jié)節(jié)

H&E染色顯示，僅在D7的SF_GYY 5%中和D21的所有支架中，出現(xiàn)了一些讓人聯(lián)想到骨樣結(jié)節(jié)的細(xì)胞聚集體。進(jìn)一步分析證實(shí)這些聚集體為AR-S+、VK+、ALP+、CSE+和VEGF+。這些數(shù)據(jù)表明它們可能被視為礦化-血管生成結(jié)節(jié)。