RNA提取

從在NMS或NMS+NO2-培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24、48和72小時(shí)的約10^9個(gè)M.album菌株BG8細(xì)胞中提取總RNA。細(xì)胞通過0.22μm過濾器過濾收獲，并用酚-乙醇終止溶液滅活。根據(jù)制造商說明書純化總核酸，并進(jìn)行以下修改：細(xì)胞裂解步驟中加入6 U蛋白酶K，總沉淀核酸用30單位DNase I處理。然后使用RNA clean&concentrator對(duì)總RNA進(jìn)行柱純化。使用BioAnalyzer和Qubit評(píng)估RNA質(zhì)量和數(shù)量。通過針對(duì)norB1或nirS基因的定量PCR評(píng)估殘留基因組DNA污染。使用M.album菌株BG8的基因組DNA和通用及基因特異性引物創(chuàng)建基因拷貝標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)制造商說明，使用SuperScript III逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

表 1 | 本研究中使用的 qPCR 引物

基因靶標(biāo)	基因座標(biāo)簽	引物組	序列 (5'→3')	qPCR 效率	標(biāo)準(zhǔn)曲線-R2	參考文獻(xiàn)
pxmA	METAL_RS06980	QpxmA-FWD-3 QpxmA-REV-3	GCTTGTCAGGGCTTACGATTA CTTCCAGTCCACCCAGAAATC	97.7%-101.8%	0.9989	本研究
pmoA	METAL_RS17425	QpmoA-FWD-7 QpmoA-REV-7	GTTCAAGCAGTTGTGTGGTATC GAATTGTGATGGGAACACGAAG	95.1%-97.2%	0.9999	本研究
nirS	METAL_RS10995	QnirS-FWD-1 QnirS-REV-1	GTCGACCTGAAGGACGATTT GTCACGATGCTGTCGTCATA	95.1%-98.8%	0.9999	本研究
norB1	METAL_RS03925	QnorB-FWD-2 QnorB-REV-2	ACTGGCGGTGCACTATTT CATCCGGTTGACGTTGAAATC	97.2%-97.4%	0.9998	本研究
norB2	METAL_RS13345	QnorB-F-1 QnorB-R-1	CACCATGTACACCCTCATCTG CCAAAGTCTGCGCAAGAAAC	96.2%-102.2% 96.1%-101.8%	0.9999 0.9999	本研究 本研究
16S rRNA	METAL_RS04240	341F 518R	CCTACGGGAGGCAGCAG ATTACCGCGGCTGCTGG	96.9%-102.2%	0.9997	Muyzer et al.,1993

定量PCR

使用M.album菌株BG8的基因組DNA和通用及基因特異性引物創(chuàng)建基因拷貝標(biāo)準(zhǔn)品。

制備純化擴(kuò)增產(chǎn)物的10倍稀釋系列，用于建立優(yōu)化的qPCR條件。每個(gè)20μl反應(yīng)包含10μl 2X qPCR SYBR預(yù)混主試劑、0.2 uM正向和反向引物、1 ul稀釋的cDNA和無核酸酶水。在StepOne Plus qPCR系統(tǒng)上進(jìn)行擴(kuò)增，初始活化95°C 3分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增（95°C 15秒，60°C 15秒，72°C 15秒）并收集熒光發(fā)射數(shù)據(jù)。通過熔解曲線分析評(píng)估靶標(biāo)特異性，確保獲得單峰。從稀釋10^-3至10^-5的cDNA估計(jì)16S rRNA和pmoA轉(zhuǎn)錄本分析的基因拷貝數(shù)，從稀釋10^-1至10^-3的cDNA估計(jì)nirS、norB1、norB2和pxmA轉(zhuǎn)錄本分析的基因拷貝數(shù)。每個(gè)功能基因的轉(zhuǎn)錄本豐度均歸一化為16S rRNA的轉(zhuǎn)錄本豐度，得到每十億個(gè)16S rRNA拷貝的轉(zhuǎn)錄本拷貝數(shù)。然后，為了計(jì)算N倍變化，我們將NMS+NO2-培養(yǎng)物中的轉(zhuǎn)錄本豐度除以NMS培養(yǎng)物中的轉(zhuǎn)錄本豐度。樣品在至少三個(gè)在不同日期生長(zhǎng)和處理的生物學(xué)重復(fù)上，每個(gè)重復(fù)進(jìn)行三次稀釋，每個(gè)稀釋度運(yùn)行三次技術(shù)重復(fù)。定量PCR效率范圍在95-102%之間，所有檢測(cè)的r2值至少為0.99。

統(tǒng)計(jì)學(xué)

使用學(xué)生t檢驗(yàn)（雙尾）計(jì)算對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組重復(fù)之間的P值。使用雙樣本F檢驗(yàn)確定對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間的方差相等性。倍增時(shí)間、O2和CH4消耗、細(xì)胞密度以及總頂空O2和CH4消耗量在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間具有相等的方差；因此，對(duì)上述比較計(jì)算了同方差性t檢驗(yàn)。對(duì)于qPCR，在48小時(shí)時(shí)，NMS+NO2-與單獨(dú)NMS之間對(duì)pmoA、pxmA、nirS和norB1的比較，以及在72小時(shí)時(shí)對(duì)pxmA和nirS的比較顯示方差不相等；因此，使用異方差性t檢驗(yàn)計(jì)算這些比較的P值。在所有其他時(shí)間點(diǎn)，所有其他基因的NMS+NO2-與單獨(dú)NMS之間的方差是相等的。

結(jié)果

在不存在或存在NO2-條件下Methylomicrobium album菌株BG8的生長(zhǎng)表型

在120小時(shí)內(nèi)培養(yǎng)Methylomicrobium album菌株BG8，以確定NO2-對(duì)生長(zhǎng)、O2和CH4消耗以及N2O產(chǎn)生的影響（圖1）。保持總氮量恒定以消除處理間氮可用性和鹽濃度的差異。所有培養(yǎng)物起始的氧氣張力為19.5±0.7%（圖1B）。正如先前觀察到的，添加NO2-對(duì)M.album菌株BG8的生長(zhǎng)或底物消耗沒有抑制作用（圖1A-C）。所有培養(yǎng)物中的限制性底物是O2，這通過在生長(zhǎng)48小時(shí)后向培養(yǎng)物補(bǔ)充額外的O2并觀察到與未接收額外O2的培養(yǎng)物相比光密度顯著增加來證明。N2O的產(chǎn)生僅發(fā)生在NMS加NO2-的培養(yǎng)物中（圖1D）。當(dāng)O2達(dá)到頂空的約1.8%時(shí)，在添加NO2-的培養(yǎng)物頂空中首次出現(xiàn)N2O產(chǎn)生，并以每小時(shí)每個(gè)細(xì)胞9.3×10^-18 mol N2O的速率持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束（120小時(shí)）（圖1D）。生長(zhǎng)120小時(shí)后，在NMS+NO2-培養(yǎng)物中，添加的NO2-的N2O產(chǎn)率百分比為5.1±0.2%。

靜息細(xì)胞在大氣和低氧O2張力下利用單一或雙碳底物或銨鹽的O2消耗和N2O產(chǎn)生

為了確定支配M.album菌株BG8中N2O產(chǎn)生的條件，我們測(cè)量了以CH4作為唯一碳源和能源的M.album菌株BG8的瞬時(shí)O2消耗和N2O產(chǎn)生。將CH4引入腔室立即導(dǎo)致O2消耗；約3分鐘后O2下降至微電極檢測(cè)限以下（圖2A）。向腔室中添加NO2-導(dǎo)致在O2下降至檢測(cè)限以下后不久產(chǎn)生N2O（圖2B）。在沒有NO2-的情況下，我們未觀察到可測(cè)量的N2O產(chǎn)生（圖2A）。盡管當(dāng)N2O明顯時(shí)O2濃度低于50 nM，但重要的是要注意M.album菌株BG8仍然需要O2進(jìn)行甲烷氧化，并且不能在缺氧條件下生長(zhǎng)。

使用上述相同的設(shè)置，我們向MR腔室中的靜息細(xì)胞補(bǔ)充CH3OH、CH2O、HCO2H、C2H6或C2H6O，以通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證除CH4以外的其他碳基還原劑源是否支持M.album菌株BG8的脫氮作用。此外，為了證實(shí)我們測(cè)試的所有一碳和兩碳源都可以在缺氧條件下作為M.album菌株BG8脫氮作用的直接電子供體，我們向靜息細(xì)胞提供僅夠消耗MR腔室中存在的溶解O2的還原劑，而不留多余的還原劑來支持脫氮作用（圖3）。然后，我們通過向含有補(bǔ)充了NaNO2的培養(yǎng)基的MR腔室中連續(xù)添加少量CH4、CH3OH、CH2O、HCO2H、C2H6或C2H6O來測(cè)量瞬時(shí)N2O產(chǎn)生（圖3）。對(duì)于所有六種底物，N2O的產(chǎn)生與添加的底物量是化學(xué)計(jì)量關(guān)系的（圖3）。

許多甲烷氧化菌，包括M.album BG8，由于與氨氧化細(xì)菌具有同源基因庫(kù)，可以將NH3氧化為NO2-。我們旨在測(cè)試來自NH3氧化的還原劑和NO2-是否也能驅(qū)動(dòng)M.album菌株BG8的脫氮作用。將NH4Cl注入MR腔室后，腔室中的靜息細(xì)胞迅速消耗溶解O2（圖4）。約70分鐘后，生物質(zhì)將溶解O2消耗至<50 nM，NO2-濃度達(dá)到163±5μM。O2耗盡后N2O的產(chǎn)生速率為每小時(shí)每個(gè)細(xì)胞1.2 x 10^-18 mol。

在脫氮條件下M.album菌株BG8中預(yù)測(cè)的脫氮基因的表達(dá)

M.album菌株BG8的基因組編碼幾個(gè)預(yù)測(cè)參與脫氮作用的基因。呼吸脫氮作用的第一步是將NO3-單電子還原為NO2-；這一反應(yīng)由兩種膜相關(guān)異化硝酸還原酶之一執(zhí)行，但M.album菌株BG8的基因組中未編碼任何一種。脫氮作用的第二步，將NO2-單電子還原為NO，由兩種非同源性的亞硝酸鹽還原酶之一執(zhí)行，即含銅的亞硝酸鹽還原酶或含細(xì)胞色素cd1的亞硝酸鹽還原酶，其中后者在基因組中被注釋。M.album菌株BG8的基因組還包含兩個(gè)拷貝的推定性細(xì)胞色素c依賴性一氧化氮還原酶。我們還研究了pxmABC操縱子中pxmA基因的表達(dá)，該操縱子編碼一種與顆粒性甲烷單加氧酶進(jìn)化相關(guān)的CuMMO。我們選擇檢查M.album菌株BG8中pxmA的表達(dá)，以確定該基因是否響應(yīng)與M.denitrificans FJG1類似；M.denitrificans FJG1中pxmABC操縱子的表達(dá)響應(yīng)脫氮條件而顯著增加。

為了評(píng)估添加NO2-對(duì)基因表達(dá)的影響，我們使用在單獨(dú)NMS中生長(zhǎng)的培養(yǎng)物作為對(duì)照。生長(zhǎng)24小時(shí)后，NMS和NMS+NO2-培養(yǎng)物頂空中的O2濃度分別約為17.2%和16.9%（圖1B）。在添加NO2-的培養(yǎng)物中，pmoA、pxmA、nirS和norB1的轉(zhuǎn)錄水平在24和48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)顯著高于單獨(dú)NMS的培養(yǎng)物（圖5）。在72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，與單獨(dú)NMS培養(yǎng)物相比，NMS+NO2-中pmoA和nirS的轉(zhuǎn)錄水平仍然顯著升高，而norB1的表達(dá)不再顯著升高（圖5）。最有趣的是，在72小時(shí)時(shí)，pxmA的轉(zhuǎn)錄本豐度在NMS+NO2-中比在單獨(dú)NMS培養(yǎng)物中高19.8倍（圖5）。第二個(gè)norB拷貝（norB2）在所有采樣時(shí)間點(diǎn)對(duì)NO2-添加均無響應(yīng)（低于兩倍）。