討論

Methylomicrobium album菌株BG8僅在低氧和NO??存在下產生氧化亞氮

M.album BG8的分批培養清楚地表明，無論是NO??還是低O?都是脫氮作用（以氧化亞氮產量衡量）所必需的。雖然先前的研究已在終點測定中表明M.album菌株BG8的分批培養物能夠產生氧化亞氮，但其脫氮作用的機制和所需條件直到現在才得以確定。M.denitrificans FJG1的氧化亞氮產生也被證明依賴于低氧條件；然而，該菌株可能由于存在一個在M.album菌株BG8基因組中缺失的narGHJI異化硝酸還原酶，除了能利用NO??外，還能呼吸NO??。M.album菌株BG8的基因組編碼推定的異化亞硝酸鹽還原酶（nirS）和一氧化氮還原酶（norB），類似于M.denitrificans FJG1；因此，M.album菌株BG8產生的氧化亞氮很可能來自通過NO中間體將NO??酶促還原為氧化亞氮。

氧化亞氮產生與低O?張力之間的相關性類似于其他兩種微生物過程：化能有機異養菌（如Paracoccus denitrificans）中的好氧脫氮作用和氨氧化細菌中的硝化菌脫氮作用。化能有機異養菌中的好氧脫氮作用和氨氧化細菌中的硝化菌脫氮作用是在O?限制期間最大化呼吸作用或消耗多余還原力的一種策略。在M.album菌株BG8的呼吸鏈中，結合使用或替代使用O?來利用NO??，將降低細胞整體的O?需求，從而為額外的CH?氧化節省O?。因此，M.album菌株BG8可能在O?限制下使用NO??作為末端電子受體以最大化總呼吸作用。M.album菌株BG8從NO??產生的氧化亞氮產率百分比（5.1±0.2%）與Nitrosomonas europaea ATCC 19718（約4.8%）相似，比Nitrosospira multiformis ATCC 25196（0.27±0.05%）高一個數量級。

M.album菌株BG8的脫氮作用由多種還原劑源酶促支持

M.album菌株BG8的靜息細胞以四種測試的C1底物（CH?,CH?OH,CH?O,HCO?H）、兩種C2底物（C?H?,C?H?O）和NH?Cl為代價，將NO??還原為氧化亞氮。這些數據表明，甲烷氧化途徑的中間體以及pMMO、MDH和可能的羥胺脫氫酶的共底物支持呼吸性脫氮作用。這些結果與之前對甲烷氧化菌Methylocystis sp.菌株SC2的研究一致，該菌在缺氧條件下將CH?OH氧化與脫氮作用相耦合。值得注意的是，我們測試的兩種C2化合物——C?H?和C?H?O——都支持脫氮作用。甲烷氧化菌利用C2化合物支持脫氮作用的能力可能具有環境意義，因為天然氣中含有約1.8-5.1%（v/v）的乙烷。此外，乙醇是初級發酵菌在有機化合物厭氧分解過程中的重要產物。結果還表明，從NH?氧化為NO??衍生的電子被M.album菌株BG8中的亞硝酸鹽和一氧化氮還原酶有效利用，這代表了甲烷氧化菌產生氧化亞氮的另一種途徑，該途徑不直接依賴于單碳代謝，前提是甲烷單加氧酶可以獲得內源性還原力。

瞬時O?消耗和氧化亞氮產生的測量結果為C1-C2底物和氨的分解代謝在M.album菌株BG8中與低氧條件下的NO??還原直接耦合提供了強有力的支持。一些好氧甲烷氧化菌發酵CH?并排泄有機化合物，如檸檬酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽和乳酸鹽。一些研究還表明，脫氮作用僅發生在以甲烷喂養的含有甲烷氧化菌和反硝化菌的共培養物中，因為過去認為甲烷氧化菌無法厭氧分解有機化合物。盡管M.album菌株BG8在提供CH?的缺氧條件下可能排泄有機化合物，但CH?OH、CH?O、HCO?H、C?H?、C?H?O或NH?氧化支持脫氮作用的能力明確證明了甲烷氧化菌特異性酶學與單個生物體內脫氮活性之間的聯系。

預測的脫氮基因nirS和norB1的轉錄響應NO??而增加，但不響應低氧

好氧甲烷氧化菌中nirS同源物的表達迄今為止僅在呼吸NO??的M.denitrificans FJG1中被研究過。有趣的是，M.denitrificans FJG1的基因組同時編碼含銅的（nirK）和含細胞色素cd1的（nirS）亞硝酸鹽還原酶，并且只有nirK的穩態mRNA水平在同時響應O?限制和NO??可用性時增加。就只擁有nirS同源物的M.album菌株BG8而言，我們表明該nirS轉錄本的豐度對NO??處理呈陽性響應，但對O?限制無響應。這表明僅NO??的可用性就能引發nirS的表達，盡管缺氧是NO??還原發生所必需的。

細胞色素c依賴性一氧化氮還原酶（norB）在好氧甲烷氧化菌的基因組中廣泛存在。這部分可能是由于需要通過將其還原為氧化亞氮來解毒在好氧氨氧化過程中產生的NO。在用0.5 mM硝普鈉（一種釋放NO的化合物）處理后，Methylococcus capsulatus菌株Bath中norB的表達增加了4.8倍。由于該基因組缺少異化亞硝酸鹽還原酶，NorB蛋白可能參與了M.capsulatus菌株Bath氨氧化過程中的NO解毒作用。最近，在恒化器生長期間，證明M.fumariolicum菌株SolV中norB的轉錄在O?限制下上調；然而，尚不清楚M.fumariolicum菌株SolV是否可以消耗NO??或NO。M.denitrificans FJG1中norB的轉錄響應NO??和低氧而增加了2.8倍。雖然M.album菌株BG8的基因組編碼兩個拷貝的norB基因，但只有一個拷貝（norB1）后面跟著norC——必需的含細胞色素c的亞基。盡管一些生物體如Cupriavidus necator擁有兩個獨立的功能性一氧化氮還原酶，但目前的工作表明，只有norB1在M.album菌株BG8中的表達對NO??處理有響應。盡管NorB的功能在M.album菌株BG8和M.capsulatus菌株Bath之間可能不同，但這兩種細菌都顯示出norB基因對NO??的相似轉錄響應。

pxmA的轉錄本豐度響應NO??和低氧而顯著增加

屬于γ-變形菌門的一些好氧甲烷氧化菌的基因組已被證明編碼一個序列差異的CuMMO蛋白復合物，即pXMO。由pxm操縱子編碼的推定性pXMO蛋白的功能和底物仍然未知。先前對pxm操縱子的研究表明，它在Methylomonas sp.菌株LW13以及淡水泥炭沼澤和小溪沉積物中生長時以低水平表達。對油砂尾礦池中SIP標記的活性群落的宏基因組測序顯示，pxmA序列存在于活性甲烷氧化菌群落中。對M.denitrificans FJG1轉錄組的分析表明，pxmABC操縱子的穩態mRNA水平響應脫氮條件增加了約10倍。

我們現在證明，M.album菌株BG8中pxmA的表達響應NO??和低氧而顯著增加。我們在未發生脫氮作用的O?限制的單獨NMS培養物中未觀察到pxmA表達的任何增加，這表明僅低氧不足以增加穩態mRNA水平。這項研究進一步支持了pxmA表達對脫氮條件有響應的觀察結果。然而，必須指出，在添加NO??的培養基中，pxmA的絕對轉錄本豐度比pmoA的絕對轉錄本豐度低三個數量級。

結論

本研究證明了一種好氧甲烷氧化菌——M.album菌株BG8——在O?限制下，將C1（CH?,CH?OH,CH?O,HCO?H）、C2（C?H?,C?H?O）和無機（NH?）底物的氧化與NO??還原相耦合，導致強效溫室氣體氧化亞氮的釋放。將C1、C2和無機能源與O?呼吸和脫氮作用相耦合的能力賦予了M.album菌株BG8相當大的代謝靈活性。我們提出了一個M.album菌株BG8中甲烷驅動脫氮作用的模型（圖6）。這一發現對甲烷氧化細菌在全球氮循環中，無論是在氧化亞氮排放還是氮損失方面，的環境作用具有啟示意義。將呼吸NO??的M.album菌株BG8的基因組和生理學與呼吸NO??的M.denitrificans FJG1進行比較表明，M.album菌株BG8無法將NO??還原為氧化亞氮可能是由于其基因組中缺少異化硝酸還原酶，但推定的脫氮基因nirS和norB1的表達使這種好氧甲烷氧化菌能夠呼吸NO??。