4.討論

在這項工作中，我們評估了我們小組最近開發的H2S釋放SF支架促進成骨分化和增加hMSCs礦物沉積的能力。我們的結果提供了證據，表明將H2S供體與SF結合可增強支持成骨分化的能力，并證明了H2S釋放支架可能代表一類用于骨組織再生的新型生物材料。

雖然在這項工作中我們沒有進行H2S釋放SF與攜帶其他生物因子或藥物的SF基支架之間的直接比較，但我們的研究結果表明，H2S釋放SF支架具有結合骨合成代謝效應和刺激血管生成因子能力的獨特特征；此外，H2S在生理濃度下作為一種細胞保護劑和抗氧化劑具有既定的生物活性。因此，可以想象，基于H2S的支架可能是一種有效且安全的選擇，既能刺激骨形成，又能延長骨祖細胞的壽命。

在我們之前的工作中，我們報道了一種將H2S供體GYY加入通過鹽浸法制備的SF支架的新方法。使用紅外光譜和NMR分析，證明了GYY成功地結合到SF支架中，并且GYY的H2S釋放特性至少保持2.5小時。在這里我們證實，SF基質在水解后至少12小時內釋放H2S，從而擴展了我們先前的觀察結果；特別是，通過電流測量監測的H2S釋放似乎與加載的GYY量成正比。在這項工作中，H2S是從支架中嵌入的緩釋H2S供體釋放的，而不是通過支架中嵌入的H2S生成酶的酶促作用化學產生的。通過這種方法，H2S釋放SF支架將實現局部和持續的H2S釋放，而不受微環境中底物量的影響。此外，我們發現H2S誘導了CSE蛋白表達的上調，CSE是負責H2S生產的關鍵酶之一。這種正反饋環很有趣，因為它可能表明微環境中H2S濃度的進一步增加，且不依賴于從支架釋放的H2S。

在這項工作中，為了探索SF_GYY修復骨組織的潛力，骨組織是一種堅硬、有韌性且內部多孔的組織，考慮到支架需要具有合適的結構和彈性模量，以允許新組織形成并保留在指定的空間中。支架顯示出高度多孔的海綿狀結構，孔徑最大為350μm，被認為適用于骨組織再生應用的支架。在骨組織愈合過程中，當產生軟痂時，具有在kPa和MPa范圍內的彈性模量的半剛性工程化基質被認為是支持hMSCs向成熟骨細胞分化的支架。SF和SF_GYY支架的楊氏模量值均低于成熟人骨的楊氏模量，因此該支架可作為臨時支撐，用于膠原蛋白的生產和ECM無機相的沉積，不應在需要替代成熟骨的應用中使用。

除了H2S釋放和機械性能外，生物相容性是組織工程應用的基本要求。該支架旨在逐漸釋放一定量的H2S，從而避免突釋現象的風險，突釋現象可能導致在短時間內出現超生理濃度的H2S風險。支架釋放的H2S量與生理濃度范圍（從500 nM到200μM）一致。一致地，我們的研究結果表明，GYY表面功能化對hMSCs無細胞毒性，正如我們所證明的，它保持了活力，并且不會negatively干擾細胞遷移和定殖。這些數據與H2S眾所周知的抗氧化、抗炎和細胞保護作用一致，也得到我們先前研究的證實，該研究顯示H2S供體處理的hMSCs沒有細胞毒性。

此外，基于H2S公認的促合成代謝作用，我們的支架設計的最終目標是提高再生SF的成骨活性。據我們所知，我們的工作是第一個報道用于骨再生的H2S釋放支架的生成，因為之前開發的少數H2S釋放支架已用于心臟和傷口再生評估。該研究的主要發現是，H2S供體增加成骨分化和骨形成的能力，最近由我們和其他人報道，在此被我們的支架保留。我們發現SF_GYY 5%支架提前并增加了礦物沉積，無論是在hMSCs內部還是在SF基質上，這與以下證據一致：鈣-磷酸鹽復合物在早期階段在細胞內的囊泡中積累，并且SF纖維模擬非膠原蛋白的陰離子性質，從而有利于其沉積。此外，我們發現從SF_GYY培養培養基中收集的非粘附hMSCs，而非從對照SF支架中收集的，具有產生礦化基質的能力。這些數據表明，H2S誘導hMSCs向成骨分化commitment，且不依賴于它們對骨傳導生物材料的粘附。

此外，我們表明H2S刺激激活了編碼粘附分子和蛋白、生長因子以及與骨骼發育和骨礦物代謝相關的轉錄因子的廣泛基因范圍。特別是，我們首次揭示了H2S分子基因表達靶點。我們首先發現SF_GYY 5%提前上調了絕大多數成骨基因，包括ALP、BMP4和成骨分化的主調控因子RUNX2，在D7時，這些基因與對照SF中的相同基因相比增加了數倍。這些數據表明，H2S釋放支架可以觸發hMSCs中導致成骨分化的轉錄程序的早期激活。

值得注意的是，BGLAP的表達被認為是成骨分化和骨形成的典型晚期標志物，在SF_GYY中也顯著增加，并在D21達到峰值，與D0相比顯著增加了6倍，與D21的對照SF相比增加了超過2倍。

先前的發現表明，BMP2是BMP通路的一個成員，可能是介導H2S對MSCs作用的重要參與者。我們的數據證實，H2S刺激顯著誘導了屬于BMP信號通路基因的表達。在這些基因中，DLX-5是我們分析中SF_GYY 5%最consistently上調的基因之一，與D0相比顯著增加了10倍，與D21的對照SF支架相比顯著增加了7倍。DLX-5是成骨的正向調節因子，并抑制破骨細胞分化，因此我們可以推測DLX-5可能是負責H2S先前描述的促進骨形成和抑制骨吸收作用的靶點之一。此外，我們的數據表明BMPR2是H2S依賴性效應的另一個重要參與者。

在整合素中，我們發現ITGA2表達在D21時SF_GYY 5%中顯著高于對照SF。ITGA2與其他整合素一起，先前被描述為激活Wnt/β-catenin通路和其他信號通路，并調節成骨分化。

在細胞外基質分子中，我們發現COMP在對照SF中從D0到D7顯著上調，并且其表達在SF_GYY支架中增加。COMP是一種細胞外基質蛋白，其突變導致骨礦物質密度(BMD)、骨質量、機械強度和軟骨下骨厚度降低；它已與BMP-2聯合使用以增強體外和體內成骨。此外，SF_GYY 5%誘導了COL15A1的表達，該基因先前被顯示與hMSCs向成骨分化進展相關。

有趣的是，我們發現從D0開始，H2S顯著上調了屬于BMP通路的兩個基因，表明在實驗的接種階段和成骨刺激之前，H2S快速實現了成骨commitment。盡管我們尚未研究SF_GYY 5%在體外和體內沒有成骨因子的情況下誘導hMSCs長期成骨分化的能力，但這些數據使我們推測，將H2S加載到再生SF中可能使支架本身具有骨誘導性，而不僅僅是骨傳導性。異位骨形成模型的進一步研究將闡明，未預先接種細胞的SF_GYY支架本身是否具有骨誘導性，從而可能彌合組織工程策略與臨床之間的差距。

最后，同樣重要的是發現VEGFA被H2S顯著上調。雖然先前在另一種組織中報道了H2S介導的VEGFA表達，但這一證據在骨組織工程領域具有重要意義。實際上，許多有前景的支架未能獲得臨床相關性的一個關鍵限制是，由于缺乏新血管生成或宿主血管系統緩慢穿透，它們的整合存在缺陷。通過促進ALP和其他多種成骨標志物的表達，并通過誘導hMSCs產生VEGF，H2S釋放SF可能構成一種創新的功能化策略，可以在促進新血管生成的同時實現成骨，特別是在局部H2S耗竭的病理狀況下。

5.結論

本研究證明，將SF支架加載H2S供體是促進骨再生部位成骨分化的合適策略。H2S釋放觸發無機礦物基質的沉積，并促進hMSCs表達成骨基因和生產促血管生成因子。我們得出結論，H2S可以顯著提高基于SF生物材料的現有骨組織工程方法的efficacy。