實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)  

在用于實(shí)驗(yàn)的12天中，每天測(cè)量一個(gè)或兩個(gè)玫瑰座，每個(gè)含有五個(gè)胚胎和一個(gè)空玻璃毛細(xì)管，測(cè)量?jī)纱巍？偣矞y(cè)量了78個(gè)牛胚胎，在八細(xì)胞階段（第3天；n=18）和 various 囊胚階段（第7天；n=60）。第3天和第7天胚胎在不同實(shí)驗(yàn)日測(cè)量。隨后對(duì)78個(gè)胚胎中的64個(gè)進(jìn)行性別診斷（14個(gè)第3天胚胎；50個(gè)第7天胚胎）。我們的標(biāo)準(zhǔn)體外生產(chǎn)系統(tǒng)（實(shí)驗(yàn)期間平均卵裂率和囊胚率分別為78%和42%；）作為所用胚胎質(zhì)量的對(duì)照。  

統(tǒng)計(jì)分析  

邏輯回歸用于確定每個(gè)胚胎第一次和第二次氧氣測(cè)量之間的關(guān)聯(lián)以及氧氣梯度剖面的線性ity。

呼吸速率測(cè)試殘差的正態(tài)分布。基于這些結(jié)果，數(shù)據(jù)隨后使用混合線性模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，包括玫瑰座、受精后小時(shí)數(shù)、胚胎直徑、階段、形態(tài)、性別以及形態(tài)和性別的交互作用作為系統(tǒng)（固定）因素。模型的隨機(jī)部分包含玫瑰座和測(cè)量日期之間的交互作用。最小二乘均值（LSM）由先前模型在移除交互作用后產(chǎn)生，因?yàn)榛诜治鼋Y(jié)果認(rèn)為交互作用不顯著。  

第3天和第7天的平均呼吸速率使用混合線性模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，包括天數(shù)作為固定效應(yīng)。LSM從先前模型生成。數(shù)據(jù)表示為L(zhǎng)SM±標(biāo)準(zhǔn)誤。  

影響胚胎直徑的因素使用混合線性模型評(píng)估。模型包括玫瑰座、受精后小時(shí)數(shù)、胚胎形態(tài)和階段作為固定效應(yīng)，以及玫瑰座和測(cè)量日期之間的交互作用作為隨機(jī)效應(yīng)。  

性別比與預(yù)期50:50比通過(guò)校正卡方程序比較。  

結(jié)果  

結(jié)果 用于氧測(cè)量的胚胎性別比例 選擇用于氧測(cè)量的胚胎中，雄性與雌性胚胎的比例為64：36，與預(yù)期的50：50比例在第3天和第7天均存在顯著偏離（表1；P < 0.05）。在49例完成性別鑒定和形態(tài)學(xué)評(píng)估的囊胚中（表2），既往觀察到的性別比例（64：36）在組間（P > 0.10）和組內(nèi)（P > 0.05）均無(wú)顯著差異。

氧氣測(cè)量的一致性和準(zhǔn)確性

超微呼吸系統(tǒng)顯示出高準(zhǔn)確性，在空對(duì)照毛細(xì)管內(nèi)的表觀氧氣消耗可忽略不計(jì)，為 0.034 ± 0.055 nl/h (n=18)。由單個(gè)胚胎呼吸產(chǎn)生的梯度顯示出極好的線性（圖3），判定系數(shù) (r2) 為 0.999。這種線性證實(shí)了 1 小時(shí)的孵化期足以在玫瑰座的玻璃毛細(xì)管內(nèi)建立穩(wěn)定條件。此外，每個(gè)胚胎的測(cè)量快速完成，單個(gè)呼吸速率測(cè)定在 8 分鐘內(nèi)完成。

對(duì)同一胚胎進(jìn)行的第一次和第二次氧氣測(cè)量結(jié)果（間隔 76 ± 8 分鐘）非常一致（圖4），兩個(gè)數(shù)據(jù)集之間的回歸得出的判定系數(shù) (r2) 為 0.9705 (n=71; P < 0.0001)。此外，回歸線的斜率非常接近 1（即 0.978），表明第一次和第二次測(cè)量之間呼吸速率僅輕微下降了 2.2%。統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)該斜率與 1 無(wú)顯著差異 (P > 0.05)，因此從第一次到第二次測(cè)量速率的輕微下降是不顯著的測(cè)量誤差。

胚胎的平均呼吸速率既不受測(cè)量中使用的玫瑰座的影響（玫瑰座 1 vs 2；P = 0.69），也不受進(jìn)行測(cè)量時(shí)受精后時(shí)間的影響 (P = 0.31)。

單個(gè)胚胎的呼吸速率

第 3 天胚胎的平均呼吸速率為 0.38 ± 0.011 nl/h (n=18；范圍 0.31-0.51 nl/h)，顯著增加 (P < 0.001) 至第 7 天胚胎的 1.30 ± 0.064 nl/h (n=60；范圍 0.46-2.67 nl/h)（圖5）。

胚胎形態(tài)、性別、質(zhì)量、直徑和發(fā)育階段對(duì)呼吸速率的影響

胚胎直徑直接受胚胎階段 (P < 0.01) 和形態(tài) (P < 0.01) 的影響，因?yàn)楦砥陔A段和更高質(zhì)量的胚胎與更大的直徑相關(guān)。

呼吸速率直接受胚胎直徑影響 (P < 0.05)，因?yàn)檩^大的胚胎與較高的呼吸速率相關(guān) (y = 9.06 ± 3.71 nl/h x mm；圖6)。

對(duì)于第 7 天囊胚，呼吸速率隨形態(tài)質(zhì)量成比例下降（圖7），質(zhì)量 1、2、3 和 4 胚胎的呼吸速率分別為 1.72 ± 0.18a (n=18)、1.23 ± 0.14b (n=23)、1.07 ± 0.14b (n=14) 和 0.81 ± 0.22b (n=4) nl/h (a,b: P < 0.01)。質(zhì)量 1 胚胎的呼吸速率最高，顯著不同于所有其他質(zhì)量等級(jí)，而其他質(zhì)量等級(jí)之間的呼吸速率隨質(zhì)量等級(jí)下降幅度較小（圖7）。

第 3 天胚胎的平均呼吸速率在雄性和雌性之間相同 (0.38 ± 0.02 nl/h)。類(lèi)似地，在第 7 天胚胎中，平均呼吸速率在性別之間沒(méi)有差異（雌性為 1.29 ± 0.12 nl/h，雄性為 1.12 ± 0.11 nl/h；P = 0.10）。

討論

本研究提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)，證明此處描述的新型非侵入性微傳感器技術(shù)在測(cè)量單個(gè)牛胚胎的呼吸速率方面是準(zhǔn)確、快速和可重復(fù)的。氧氣梯度表現(xiàn)出的優(yōu)異線性以及第一次和第二次測(cè)量之間的密切關(guān)系證明了所獲結(jié)果的一致性。實(shí)際上，濃度梯度在非常接近胚胎或毛細(xì)管開(kāi)口頂部時(shí)可能會(huì)偏離完美線性。然而，由于我們的測(cè)量是在距離胚胎和頂部超過(guò) 500μm 處進(jìn)行的，這些偏差可以忽略不計(jì)，并且不影響梯度的線性。此外，所使用的傳感器尺寸小，不會(huì)破壞流向胚胎的氧氣通量，也不會(huì)干擾胚胎呼吸產(chǎn)生的氧氣梯度，這從測(cè)量到的線性氧氣梯度可以明顯看出。

采用濕潤(rùn)的 5% CO? 在 19% O? 中的恒定氣流是為了確保穩(wěn)定的氧氣條件，因?yàn)闇y(cè)量是在半封閉系統(tǒng)下進(jìn)行的，且 19% O? 更接近正常大氣條件（21% O?）。盡管先前的研究報(bào)告稱(chēng)培養(yǎng)期間使用的氧氣濃度會(huì)影響胚胎發(fā)育、細(xì)胞數(shù)量和基因表達(dá)，但我們認(rèn)為在氧氣測(cè)量期間將胚胎轉(zhuǎn)移到不同 O? 濃度培養(yǎng)基中相對(duì)較短的時(shí)間不會(huì)對(duì)胚胎代謝產(chǎn)生顯著影響。在整個(gè)測(cè)量過(guò)程中注意到燒杯內(nèi)培養(yǎng)基有輕微蒸發(fā)。然而，玫瑰座完全浸沒(méi)在大量培養(yǎng)基（80ml）中，并且如此大體積培養(yǎng)基的表面積與體積比相對(duì)較低，因此大量培養(yǎng)基體積的蒸發(fā)微不足道。